背景及应用

恶性肿瘤从原发瘤或继发瘤向邻近的宿主组织侵犯或占领称为侵袭。检测肿瘤侵袭能力是判断肿瘤转移能力的一种方法。如(图1)所示，肿瘤细胞侵袭发生在转移的第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期定植到其他组织并增殖。利用transwell侵袭实验可以检测肿瘤细胞的侵袭能力。trans有转移、转运之意，well有小室之意，transwell合起来就是穿过小室。未铺胶的transwell实验检测细胞的迁移能力，铺胶的transwell实验检测细胞的侵袭能力。迁移和侵袭是两个概念。迁移是指细胞的运动能力，而侵袭是细胞在运动的同时会分泌出消化ECM的蛋白，清除运动障碍，这个实验更能模拟人体内环境。

transwell侵袭实验的基本原理：

transwell小室在培养板中，小室内称上室，小室放入的培养板称下室，上室底部为一层聚碳酸酯膜，这层膜具有通透性，将上室培养液和含下室培养液隔开，下室中的培养液可以影响上室中的细胞，从而研究下室中液体对细胞的生长、迁移的影响，细胞接种到低营养的培养液里，通常膜孔都被ABW®Matrigengel覆盖，模仿细胞外基质，肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有ABW®Matrigengel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

一、准备工作

1.实验材料

①生长状态良好、汇合度达70%-80%的细胞

②培养基：无血清培养基、含10%FBS的完全培养基

③耗材：200ul、1.5ml EP管、放有8um Transwell小室的24孔板

④其他：胰酶、PBS、结晶紫染液、4％多聚甲醛、Matrigengel

2.在冰上4℃过夜融化Matrigengel，实验前转移到冰盒中。

3.将200ul枪头、1.5ml EP管、放有Transwell小室的24孔板和无血清培养基提前-20℃预冷，实验前转移到冰盒中。

二、实验步骤

A.准备基质胶

1.4℃隔夜解冻Matrigengel，实验前转移到冰盒中。

2.将提前准备好的冰放置冰盒中，凝胶前的操作均在冰上操作。将枪头、离心管与放有Transwell小室的24孔板放入冰盒预冷，并用预冷枪头将Matrigengel混匀。

B.基质胶铺板

1.稀释Matrigengel：先将8µL Matrigenge加入预冷的1.5ml EP管中，然后加入64µL预冷的无血清培养基，并用枪头吹打充分混匀。（Matrigenge和无血清培养基以1:8的比例稀释）

2.吸取60µL 稀释后的Matrigengel，垂直加入Transwewll上室中，均匀平铺在底部。

3.放入培养箱（37℃，5%CO2)中孵育3h，使Matrigengel聚合成薄膜。（注意：铺胶过程不要产生气泡，均匀铺胶。）

4.孵育后将上室中多余液体吸掉，在每孔中加入100 µL无血清培养基后，于培养箱放置30min，进行基底膜水化。

5.将上室中液体吸掉，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可以接种细胞。

C.制作细胞悬液

1.制作细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。（此步骤可选择操作，如果细胞迁移能力不强，可考虑进行此步骤增加血清对细胞的诱导。）

2.取汇合度达70%-80%的细胞进行消化并离心弃废液，然后用无血清培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度至2.5×105/mL。（不同细胞大小和迁移能力不同，可设置浓度5×104/mL 、2.5×105/mL、5×105/mL摸索合适的浓度。）

D.接种细胞

1.在24孔板下室加入500µL含10%FBS培养基。然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内（注意：下层培养液和小室间经常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）

2.每孔加入200µL细胞悬液到Transwell上室中。

3.培养箱培养24h后可进行固定染色。（时间点可根据肿瘤细胞侵袭能力而定，一般24-48h，还需要考虑细胞状态和消化时间对细胞的影响。另外建议最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确保没有大气泡产生。）

E.细胞固定

1.取出Transwell小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigengel和上室内的细胞。

2.在24孔板干净的孔中加入4％多聚甲醛600µL，将小室放入后固定20-30min。

F.细胞染色及计数

1.弃去固定液，将小室在盛有PBS的6cm皿中涮洗1遍。（注意避免触碰到小室底部）

2.用0.1%结晶紫染色5-10min，PBS涮洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。

3.适当风干后，在10倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。