本发明涉及分析化学领域，具体是一种用碳点催化h2o2-tmb反应产物荧光测定so32-的方法。

背景技术：

荧光分析法是利用物质的特定荧光特性从而对其进行定性或定量分析的方法，具有灵敏度高、选择性强、方法简单等特点，广泛应用于环境、食品、医学等领域。例如：一种基于喹禾灵-对乙基(qpe)-曙红y(ey)-pd(ii)螯合物对ey的荧光猝灭作用建立的检测qpe的方法，线性范围为0.04-1.0μg/ml、检测限为20.3ng/ml；利用mos2纳米片对半导体量子点(qds)的荧光猝灭用于检测赭曲霉毒素a(ota)的适配体-cdteqds-mos2纳米片荧光猝灭系统，线性范围为1.0-1000ng/ml、检测限为1.0ng/ml；采用线粒体靶向荧光探针(cpbt)和荧光能量共振转移(fret)建立检测活细胞中内源性次氯酸盐的方法，线性范围41.8nmol/l-12.5mmol/l、检测限为41.8nmol/l。

3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，是一种新型安全被广泛使用的色原试剂，例如：基于半乳糖氧化酶(gaox)氧化半乳糖产生h2o2，然后根据2',7'-二氟荧光素(dff)催化h2o2氧化tmb生成蓝色氧化产物建立一种检测半乳糖的新方法，线性范围10-20mmol/l、检出限为3μmol/l；采用fe/n掺杂多孔碳(nc)复合物催化氧化tmb产生蓝色产物，然后利用多巴胺(da)抑制fe/nc复合物活性使蓝色褪去，从而建立一种检测da的方法，线性范围0.01–40μmol/l、检出限10nmol/l。这些报道的方法均基于目标物与tmbox的褪色反应，用比色法测定目标物，利用产物荧光增强的方法未见报道。

亚硫酸盐(so32-)具有杀菌、防腐、溶解、抗氧化和增酸等作用，常作为食品添加剂应用于食品加工中，但是高浓度的亚硫酸盐能够引起气喘和过敏反应，因此对so32-的检测十分重要。目前常用的检测方法有高效液相色谱法、原子吸收光谱法、色谱法、电化学分析法、荧光法等。例如：有文献报道的一种电催化伏安法，是利用改性的玻璃碳工作电极以及伏安电流的变化实现对亚硫酸盐浓度的测定，检测范围为5.0×10-6-8.0×10-4mol/lso32-；一种利用超声波辅助浊点提取法(ua-cpe)预富集亚硫酸盐，随后利用火焰原子吸收光谱法检测0.04–70μg/lso32-、检出限为0.012μg/l；还有一种利用咔唑-苯并[e]吲哚染料(cebi)探针显着的荧光比率响应以及高分辨率电喷雾电离质谱(hr-esi-ms)，质子核磁共振(1hnmr)和时间密度泛函理论对加入so32-后探针光谱特征的变化进行计算，从而可测定0-300μmol/lso32-、检出限为1.74μmol/l。这些报道的方法中，大多数使用的仪器昂贵、操作繁琐。目前，利用碳点催化h2o2-tmb反应生成具有较强荧光的氧化产物(简写为tmbox)，tmbox再与so32-反应使得荧光峰强度减低用于检测so32-的荧光法尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种用碳点催化h2o2-tmb反应产物荧光测定so32-的方法。这种方法利用碳点催化h2o2-tmb反应生成具有荧光的产物，该产物再与so32-反应使得荧光峰强度减低、且与被测物so32-浓度呈线性关系，实现用荧光法定量测定so32-。该方法简便、快速、试剂无毒、灵敏度高。

实现本发明目的的技术方案是：

一种用碳点催化h2o2-tmb反应产物荧光测定so32-的方法，与现有技术不同的是，包括如下步骤：

(1)制备已知浓度的so32-标准溶液体系：于不同的刻度试管中，依次加入1μl-350μl100mg/lso32-标准溶液、100μl-180μl40μg/lcd溶液、200μl-300μl5.5mmol/lph3.3tris-hcl缓冲溶液、50μl-150μl0.5mmol/ltmb溶液和50μl-150μl100μmol/lh2o2溶液，用二次蒸馏水定容至1.5ml，混匀，于40℃水浴反应40min，冰水冷却至室温；

(2)制备空白对照溶液体系：采用步骤(1)的方法不加so32-标准溶液制备空白对照溶液体系；

(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的so32-标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光光谱仪上，设定仪器参数以276nm为激发波长扫描获得体系的荧光光谱，测定405nm处的荧光强度值为f，同时测定空白对照溶液体系的荧光强度值为f0，计算δf＝f0-f；

(4)依据δf对so32-的浓度关系做工作曲线；

(5)依照步骤(1)的方法制备样品溶液，其中加入的so32-标准溶液替换为样品溶液，并按步骤(3)的方法测定样品溶液的荧光峰强度值为f样品，计算δf样品＝f0-f样品；

(6)依据步骤(4)的工作曲线，计算出样品溶液so32-的含量。

采用现有技术制备本技术方案中的碳点(简写为cd)的制备方法是：准确称取1g葡萄糖和0.3g硫酸铵，于30ml二次蒸馏水中，搅拌使溶解完全后，转入聚四氟乙烯为衬底的高压釜内，密封后置于温度为180℃的马弗炉中反应5h，反应结束后，自然冷却到室温，即得到棕黄澄清溶液，所得的cd溶液浓度为0.032g/ml(浓度按葡萄糖浓度计算)，将该cd溶液于离心机中，调节转速为7000rpm/g，离心10min,用0.1mol/lnaoh调至中性后得到浓度为0.017g/ml，使用时稀释所需浓度。该碳点的制备方法是已有技术。

实现本技术方案的原理是：利用碳点的催化作用，即碳点能催化h2o2氧化tmb反应生成荧光产物tmbox，该荧光产物tmbox与被测物so32-进一步反应使得tmbox荧光逐渐降低，且与so32-浓度呈线性关系，实现了用荧光法定量测定so32-，据此建立了一种简便测定so32-的荧光分析方法。

这种方法的优点是：与现有的方法相比，这种方法利用碳点能催化h2o2氧化tmb生成具荧光的产物tmbox，且产物tmbox的荧光峰强度与被测物so32-浓度呈线性关系，实现用荧光法定量测定so32-，该方法简便、快速、试剂无毒、灵敏度高。

附图说明

图1为实施例中的荧光光谱示意图。

图中，a.4μg/lcd+33μmol/ltmb+0.92mmol/lph3.3tris-hcl+6.67μmol/lh2o2b.a+0.067mg/lso32-c.a+3.33mg/lso32-d.a+9mg/lso32-e.a+13.33mg/lso32-f.a+15mg/lso32-g.a+18mg/lso32-h.a+23.33mg/lso32-。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。

实施例：

一种用碳点催化h2o2-tmb反应产物荧光测定so32-的方法，包括如下步骤：

(1)制备已知浓度的so32-标准溶液体系：于7支不同的刻度试管中，依次加入1μl、50μl、135μl、200μl、225μl、270μl、350μl100mg/lso32-标准溶液、150μl40μg/lcd溶液、250μl5.5mmol/lph3.3tris-hcl缓冲溶液、100μl0.5mmol/ltmb溶液和100μl100μmol/lh2o2溶液，用二次蒸馏水定容至1.5ml，混匀，于40℃水浴反应40min，冰水冷却至室温；

(2)制备空白对照溶液体系：采用步骤(1)的方法不加so32-标准溶液制备空白对照溶液体系；

(3)分别取按步骤(1)、(2)制备的so32-标准溶液体系及空白对照溶液体系倾入石英比色皿中，在荧光光谱仪上，设定仪器参数以276nm为激发波长扫描获得体系的荧光光谱，测定405nm处的荧光强度值为f，同时测定空白对照溶液体系的荧光强度值为f0，计算δf＝f0-f，如图1所示；

(4)依据δf对so32-的浓度关系做工作曲线，获得线性回归方程为δf＝50.84c+41.8，其中so32-浓度c的单位为mg/l，测定线性范围为0.067-23.33mg/l，检出限为0.02mg/l；

(5)样品测定：购买2个品牌的啤酒为测试样品，分别吸取10ml于试管中，室温下放置15min，用二次蒸馏水稀释100倍，然后依照步骤(1)的方法制备被测样品，其中加入的so32-标准溶液替换为被测样品，按步骤(2)-(4)操作，算出被测样品的δf样品＝f0-f样品；

(6)依据步骤(4)的工作曲线，计算出被测样品so32-的含量分别为0.37mg/l、0.11mg/l。

本技术方案检测方法的验证：

取上述实施例步骤(5)中的稀释100倍的2个品牌的啤酒，加入浓度为0.25mg/l的so32-标准溶液，进行加标回收实验，求得回收率分别为99.6％、99.1％，相对标准偏差分别为3.7％、分别4.0％。说明本技术方案方法准确可靠。