CpG ODN是目前已知的最有效的刺激Th1应答的佐剂，近年，其作为肿瘤疫苗的佐剂被广泛关注。CpG ODN是TLR9激动剂，通过激活小鼠树突状细胞、B细胞、巨噬细胞以及NK细胞分泌IL-12、I型IFN、IL-6等改善抗原提呈细胞的功能，激活体液免疫和细胞免疫。Sorrentino等人研究发现施用50μg CpG ODN的小鼠的肿瘤明显大于PBS组，他们还发现在荷瘤小鼠中给予高剂量CpG ODN治疗时，导致免疫细胞产生耐受性，这反而有利于携带肺肿瘤的小鼠的肿瘤生长。本研究室在前期肿瘤疫苗研究中发现，CpG ODN低剂量免疫能抑制肿瘤生长，而高剂量免疫小鼠会促进肿瘤生长；但目前，CpG ODN从抑瘤到促瘤生长的转变机制还不甚明了。本研究拟通过体内模型研究不同剂量CpG ODN对肿瘤生长的作用，以树突状细胞为切入点，探讨不同剂量CpG ODN从抑瘤到促瘤变机制，为CpG ODN更好地在临床中应用奠定实验和理论基础。　　1.不同剂量CpG ODN免疫对黑素瘤B16荷瘤小鼠肿瘤生长的影响　　为了研究不同剂量CpG ODN对肿瘤生长的影响，首先用CpG1826和CpG2006免疫小鼠5次，于末次免疫后第7天接种B16肿瘤细胞，建立荷瘤小鼠模型，然后在接种肿瘤后第15天，处死小鼠，剥离各组肿瘤并计算肿瘤抑制率。　　结果显示，伴随着CpG ODN剂量浓度的升高，CpG1826和CpG2006对于肿瘤的生长均呈现先抑制后促进的趋势。其中，CpG182612.5μg组的抑瘤率最高，达到84.69%，而继续增加CpG1826的浓度，反而促进了肿瘤生长，CpG1826100μg组肿瘤增长率达到158.07%。同样，的CpG200612.5μg组的抑瘤率最高，达到77.22%；而CpG2006100μg组肿瘤增长率达到40.09%。结果表明低剂量的CpG ODN有抗肿瘤作用，高剂量的CpG ODN有促肿瘤作用。　　2.不同剂量CpG ODN免疫对黑素瘤B16荷瘤小鼠DC活化的影响　　为了探讨CpG ODN低剂量抑瘤和高剂量促瘤的机制，首先考虑是否是由于不同剂量的CpG ODN对DC活化成熟的影响不同所致。因此，实验中分离了荷瘤鼠的脾脏和淋巴结的DC，用流式细胞术检测了DC细胞上的CD40、CD80和CD86的表达。结果显示DC细胞CD40表达，在剂量为0~12.5μg时，随着剂量的增大而逐渐升高，12.5μg组表达最高，但是，在剂量为25~100μg时，随着剂量的增高，CD40表达逐渐降低。DC细胞CD80和CD86的表达也得到类似的结果。结果说明CpG ODN低剂量诱导DC的成熟度较高，而高剂量CpG ODN诱导DC的成熟明显低于低剂量。上述DC的表面标志的变化与CpG ODN对肿瘤生长的影响趋势一致，提示CpG ODN低剂量抑瘤和高剂量促瘤可能与DC的成熟程度不同有关。　　3.不同剂量CpG ODN对小鼠单个核细胞的影响　　为了在体外研究不同剂量CpG ODN的作用，首先利用小鼠脾脏单个核细胞建立CpG ODN作用的体外模型，采用不同剂量CpG1826刺激培养48h，通过WST-1检测分析淋巴细胞增殖能力，通过ELISA检测IFN-γ分泌分析Th1的活性，检测IL-12分泌推测抗原提呈细胞DC的成熟。结果显示，淋巴细胞增殖能力随着剂量增加而增强；小鼠脾细胞分泌IFN-γ和IL-12增加，提示CpG1826诱导Th1活化，并且剂量不同展示了不同的作用，2μg/ml以下的低剂量活性显著增加，8μg/ml以上的高剂量活性显著减弱。　　4.不同剂量CpG ODN对BMDC成熟的影响　　为了进一步分析不同剂量CpG ODN呈现抑瘤和促瘤作用的机制，分离骨髓细胞，在体外通过GM-CSF和IL-4体外刺激诱导DC成熟，使用90%以上纯度的BMDC用于研究，通过检测CD40的表达、细胞因子的分泌以及混合淋巴细胞反应观察不同剂量CpG ODN对DC成熟的影响。　　流式细胞术检测结果显示，CpG18262μg/ml组CD40表达明显增加，CpG182620μg/ml组CD40表达明显低于CpG18262μg/ml组；ELISA检测细胞培养上清中细胞因子结果显示，CpG18262μg/ml组IFN-γ和IL-12的分泌水平明显升高，CpG182620μg/ml组分泌的IFN-γ和IL-12水平比CpG18262μg/ml组分泌水平降低；IL-6分泌水平随着CpG1826浓度增大而升高，各组IL-10的分泌水平没有明显差异；通过流式细胞仪分选CD4+T细胞，将其与BMDC混合培养，通过ELISA检测细胞上清中的IFN-γ的分泌水平。结果显示，CpG18262μg/ml刺激时，IFN-γ的分泌水平显著增加，提示诱导Th1活化能力强，与2μg/ml组相比20μg/ml组IFN-γ分泌却明显下降，Th1活化能力减弱。上述结果均提示CpG ODN低剂量诱导DC成熟度较高，而高剂量诱导DC成熟度明显下降。　　5.不同剂量CpG ODN刺激BMDC后对TLR9信号通路的影响　　为了进一步探讨不同剂量CpG ODN刺激BMDC后对TLR9信号通路的影响，使用Western Blotting方法检测了TLR9信号通路蛋白相关的表达及磷酸化水平。CpG18262μg/ml刺激时，Myd88、TRIF、TRAF6蛋白表达最高，TRAF6的下游蛋白JNK、P-JNK、IκB、P-IκB、p38、P-p38蛋白表达及磷酸化最高；CpG182620μg/ml刺激时上述蛋白的表达均比CpG18262μg/ml刺激时低　　为了验证CpG1826诱导的TRAF6信号的改变是通过TLR9受体，用不同剂量的CpG1826和TLR9抑制剂CPG4084刺激BMDC48h，通过Western Blotting方法检测TRAF6蛋白。结果显示，CPG4084显著抑制了TRAF6蛋白的表达，提示CpG1826是通过TLR9诱导TRAF6改变。　　上述结果提示：CpG1826激活了MyD88/TRAF6和TRIF信号，并通过NF-κB和JNK/P38信号通路向下传导信号，高剂量CpG1826诱导的信号传导能力明显低于低剂量。　　6.TRAF6基因敲除后对BMDC细胞表面CD40表达的影响　　上述结果表明TRAF6是CpG1826信号传导的关键蛋白，而且有研究显示，CpG ODN通过TRAF6调节CD40的表达。为了进一步研究不同剂量CpG ODN诱导树突状细胞成熟的改变与TRAF6/CD40有关，使用转染试剂将TRAF6敲除质粒瞬转进入BMDC，不同剂量CpG1826刺激48h。为了探讨TRAF6基因敲除后对BMDC成熟的影响，使用流式细胞术分析细胞表面CD40的表达情况，结果显示，2μg/ml低剂量组CD40表达(32.1%)明显高于20μg/ml高剂量组(25.1%)；当TRAF6基因敲除后，低剂量组表达(18.4%)和20μg/ml高剂量组(16.2%)CD40表达均明显下调。上述结果提示，不同剂量CpG ODN通过TRAF6调控CD40表达促进DC成熟，并且低剂量诱导的DC成熟度显著高于高剂量组。　　本研究揭示了CpG ODN从抑瘤到促瘤的转变，是由于TLR9介导的TRAF6信号调控DC的成熟度不同所决定；阐明了TRAF6在CpG ODN诱导DC成熟中的重要作用，为CpG ODN更好地在临床中应用奠定实验和理论基础。