根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究及应用 |
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真菌作为人类最早利用的功能微生物之一，已成为重要的酶制剂“微生物细胞工厂”。目前已在真菌中表达了植酸酶[1]、脂肪酶[2-3]、酸性果胶酶[4]、半乳糖苷酶[5]等众多水解酶。 真菌的遗传转化一般有以下几种方法：原生质体转化法[6]、脂质体转化法[7]、电击转化法[8]、限制性酶介导整合法[9]、根癌农杆菌介导转化法(Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation，ATMT)[10]等。原生质体转化法转化周期短，但阳性率偏低且原生质体制备烦琐；脂质体转化法运载能力强，但会对细胞产生毒性且容易污染；电击转化法转化速度快但转化率较低；限制性酶介导整合法需确定内切酶的种类和浓度，不适于推广使用；ATMT相较于其他转化方法具有显著优越性，首先，该技术实现了对真菌孢子、菌丝体、菌褶、原生质体、子实体等材料的遗传转化，避免了烦琐的原生质体和渗透性敏感细胞的制备，极大简化了转化过程并降低了转化难度；其次，转化效率高，是传统转化方法的140−1 000倍[11-14]；转化子遗传稳定性高，后代转化子遗传特性仍保持85%−98%[15-17]；转化子T-DNA单拷贝插入比例高，为66%−96%[18-19]；此外，成为马拉色菌(Malassezia spp.)等特殊真菌遗传转化的有效工具[20-22]，为特殊真菌遗传研究奠定基础。 1995年，Bundock等[10]、Piers等[23]利用ATMT介导了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的遗传转化；1998年，De Groot等[13]利用ATMT转化了萎镰刀菌(Fusarium venenatum)等9种真菌；2000年，对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)进行ATMT转化[24]，并逐步应用到金针菇(Flammulina velutipes)[25]等20余种食用真菌中[26-30]；2007年已经实现了60多种真菌的遗传转化[31-34]；2019年，利用ATMT在金针菇中成功进行CRISPR/Cas9基因编辑系统研究[35-37]；到2020年，ATMT已经对100余种真菌进行遗传转化[38-39]。部分研究成果见表 1。但由于转化材料、共培养时间与温度、诱导剂浓度等多种因素的限制，至今还无一个普遍适用于大多数真菌的转化条件及指标，此技术在真菌中的应用尚不成熟[87]。本文概述了该技术在真菌领域的研究进程、技术优缺点和应用现状，主要介绍其转化机制和操作步骤，着重分析了影响转化效率的因素并对实际转化操作中的各种问题提出优化建议，此外，总结了近年来ATMT成功转化的真菌种类和在病原真菌研究及外源蛋白表达方面的研究成果，旨在为真菌遗传转化研究提供参考。 表 1 ATMT技术成功转化的真菌种类 Table 1 Fungi successfully transformed by ATM 真菌种类Fungal species 农杆菌种类Agrobacteriumspecies 双元载体Binary vectors 选择标记Screening markers 表达基因Expressed genes 转化率Conversion rate 参考文献References Mortierella alpina AGL-1 pBIG2-ura5s Hyg B ura5s gene oPpFADS17 − [40] Mortierella alpina AGL-1, EHA105 C58C1, LBA4404 pBIG2-ura5-ITs Hyg B ura5 − [41] Macrocybe gigantea EHA105 Plasmid4 Hyg B eGFP − [42] Cylindrosporiumeleocharidis − pEX4 Hyg B GFP 600–700 transformants/107 spores [11] Colletotrichungloeosporioides − PSK2251 Hyg B GFP − [43] Sclerotium rolfsii LB4404 − Basta DsRed, tdTomato, GUSPlus − [44] Aspergillus niger AGL-1 pCAMBIA Hyg B Halophilic, eosinophilic βglucosidase − [45] Flammulina velutipes EHA105 pCAMBIA0390 Hyg B FVcas9 − [37] Aspergillus niger AGL-1 pCAMBIA1301 Hyg B Rhizopus chinensis lipase 60±5 transformants/107 spores [46] Penicillium digitatum AGL-1 pPK2 Hyg B, NTC DsRed, GFP 1 240±165 transformants/106 spores [47] Morchella importuna EHA105 p1391-U-GUS Hyg B eGFP, β-glucuronidase − [30] Agaricus bisporus LB4404 pYN6981 Hyg B eGFP, β-glucuronidase 53.85% [16] Fusarium oxysporum Agr0 pXEN G418 − 250 transformants/104 spores [32] Aspergillus oryzae AGL-1 pEX2 − Knockout of Pyr G gene, DsRed 1 060 transformants/106 spores [48] Malassezia furfur, Malasseziapachydermatis AGL-1 pBHg Hyg B GFP M. furfur: 0.75%−1.5%, N. M. pachydermatis: 0.6%−7.5% [49] Flammulina velutipes LB4404 FpiC Hyg B FVCas9 6.84% [36] Trichophytonmentagrophytes EHA105 pDHt Hyg B ZafA − [50] Malassezia furfur, Malassezia sympodialis − pPZP-201BK NTC, G418 ADE2, LAC2 − [20] Penicillium digitatum AGL-1 pTFCM Hyg B Hygromycin Bphosphotransferase − [51] Harpophora oryzae AGL-1 pKOHo Hyg B eGFP − [52] Aspergillus niger AGL-1 − Hyg B Hygromycin Bphosphotransferase 35 transformants/107 spores [53] Trichoderma reesei AGL-1 pCAMBIA1300-hph-PsCT Hyg B Cellulase 13 000 transformants/106 spores [12] Cladonia metacorallifera LBA4404 pCAMBIA1300 Hyg B eGFP − [54] Flammulina velutipes GV3101 pBHG-BCA1 Hyg B HMG-box-transcription factorfvhoml − [55] Phytophthora infestans AGL-1 pBHtl Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 50−60 transformants/106 spores [56] Penicilliumchrysogenum LBA1100 AGL-1 p2PEN0014 NTC Knowlesin acetyltransferase LBA1100: 104 transformants/106 spores AGL-1: 273 transformants/106 spores [57] Trichoderma harzianum EHA105 pCAMBIA1301- perg22 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase Solid phase: 20 transformants/107 spores Lquid phase: 100 transformants/107 spores [58] Colletotrichumglloeosporioides Pens AGL-1 pCAMBIAl300 Tetracycline eGFP 300−400 transformants/106 spores [59] Ganoderma lucidum LBA4404 pCAMBIA1300 Hyg B Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, eGFP − [29] Lentinus edodes EHA105 pCAMBIA1301 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 30% [27] Aspergillus aculeatus C58C1 pBIG2RHPH2 Hyg B Polyketide synthase 30 transformants/104 spores [60] Blastocladiellaemersonii EHA105 pBINPLUS Hyg B eGFP − [61] Pleurotus ostreatus AGL-1, GV3101 pCAMBIA1300 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 75% [28] Sporothrix schenckii LBA4404, EHA105 AGL-1 pBHt1 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 600 transformants/106 spores − [62] Aspergillus japonicus EHA105 pBI-hphII Hyg B Hygromycin B phosphotransferase − [63] Curvularia lunata AGL-1, EHA105 LBA4404 pBHt1 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 85±4 transformants/106 spores [64] Cordyceps militaris AGL-1 pATMT1 pCAMBIA1300 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 30−600 transformants/105 spores [65] Mortierella alpina C58C1 pBIG2RHPH2 Hyg B Ura5 400 transformants/108 spores [66] Volvariella volvacea EHA105 pLin235 Hyg B Afp − [26] Penicillium digitatum AGL-1 pTFCM Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 60 transformants/106 spores [67] Glomus intraradices pNHFoxdsRedstuApNHATPdsRedstA − DsRed GFP pNHF: 8 300 transformants/107 spores pNHA: 1 700 transformants/107 spores [68] Trichoderma reesei AGL-1 pBIN121 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 8 500 transformants/107 protoplasts [69] Metarhizium anisopliae EHA105 pPZP201BK Glufosinate ammonium trp1 22% [34] Paecilomyces lilacinus GV3103 pCAMBIA1302 bar Chitinase, GFP − [70] Phanerochaetechrysosporium pCAMBIA Hyg B β-glucuronidase, GFP 48% [71] Flammulina velutipes AGL-1 pBG-gHg Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 16% [25] Magnaporthe grisea AGL-1 pCAMBIA1300 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase >300 transformants/106 spores [15] Agaricus bisporus AGL-1, LBA1126 pBIN19 pGREEN Hyg B Hygromycin B phosphotransferase − [72] Trichoderma viride Chitinase 30−50 transformants/105 spores [73] Trichoderma spp. AGL-1 pPK2 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 190 transformants/107 spores [74] Colletotrichumgloeosporioides AGL-1, C58C1 pDHt, pJF1 Hyg B GFP − [75] Mucor circinelloides AGL-1 pBHt2 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase − [33] Aspergillus fumigatus EHA105 pdht-hph pdht-sk Hyg B Homologous recombination knockout polyketide synthase >100 transformants/107 spores [76] Beauveria bassiana LBA1126 pAIM3 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 163±65 transformants/106 spores [77] Colletotrichum trifolii C58C1 pBIG2RHPH2 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase After optimization: 300−500 transformants /106 spores Before optimization: 150−300 transformants/106 spores [78] Rhizopus oryzae LBA1100 pKS118 Spectinomycin Kanamycin Pyr4 − [79] Aspergillus giganteus LBA1100 pUR5750 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 7 900 transformants/108 spores [14] Phytophthora infestans LBA1100 pNptII Neomycin Neomycin phosphotransferase β-glucuronidase 30 transformants/107 spores [80] Colletotrichumlagenarium C58C1 pBIG2RHPH2 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 150−300 transformants/106 spores [81] Monascus purpureus LBA1100, AGL-1 pUR5750, pBGgHg Hyg B GFP − [17] Magnaporthe grisea AGL-1 pBHt1 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 385 transformants/107 spores [82] Suillus bovinus AGL-1 pBGgHg Hyg B eGFP − [83] Agaricus bisporus − pUR5750 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase − [84] Fusarium circinatum AGL-1 pPZP201 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 2−150 transformants/105 spores [85] Fusarium oxysporum AGL-1 pCAMBIA1300 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 300−500 transformants/106 spores [86] Agaricus bisporus AGL-1, EHA105 pCAMBIA1300 Hyg B eGFP Bacterial fold: 64%, Thallus: 9% [24] Aspergillus awamoriAspergillus nigerColletotrichumgloeosporioidesFusarium venenatumTrichoderma reeseiNeurospora crassaAgaricus bisporus LBA1100 pUR5750 Hyg B Hygromycin B phosphotransferase 9 000 transformants/107 spores5 transformants/107 spores25 transformants/107 spores1 200 transformants/107 spores5 000 transformants/107 spores1 000−9 000 transformants/107 spores300−7 200 transformants/107 protoplasts [13] Saccharom ycescerevisiae Hamsem EHA105, A348, At1000, At12506, At11067 pBIN19 Kanamycin ARSI, TRPJ, GAL3 [23] Saccharomyces cerevisiae LBA1100 pBINPLUS Carboxybenzylpenicillin URA3 The probability is 1.7×10−6/cell [19] 注：−：未报道Note: −: No reference 表选项 1 ATMT转染机制及操作流程 1.1 ATMT中T-DNA转移过程农杆菌主要有根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) 2种，是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，在植物酚类物质如乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)的吸引下经创口感染进入宿主细胞，致癌(Tumor- Inducing，Ti)质粒毒力基因随即开始表达，将农杆菌的T-DNA转移至宿主细胞，完成转基因过程[88]。 农杆菌内Ti质粒上Vir (Virulence)基因区能与T-DNA边界上高度保守的约25 bp的碱基序列发生特异性结合，使T-DNA在转化过程中不受序列特异性的影响，因此可借助分子克隆技术将内源的T-DNA替换成外源基因来完成遗传转化，得到表达外源基因的植物或真菌[89]。 农杆菌转化过程主要包括：吸附宿主细胞，Vir区基因的激活，T-DNA切割、包装、转移等[90]。在一系列Vir毒力蛋白调控下将T-DNA左右边界(LB和RB，两端长约25 bp重复序列)内序列转移到真菌等宿主细胞核DNA中[89-90]。vir基因至少包含6个不同的毒力基因编码区：virA、virB、virC、virD、virE和virF，每个vir基因座对应一个Vir转录单位，其中virA为组成型表达，virB、virC、virD和virE基因仅在被植物细胞激活时表达[91]；T-DNA转移机制如图 1所示：首先AS诱导膜蛋白VirA形成复合物，使VirG磷酸化，激活Vir区转录出核酸内切酶VirD1和VirD2，2种内切酶分别在LB和RB的第3个碱基和第4个碱基之间进行切割，并持续发挥作用，T-DNA的被切割片段从Ti质粒中释放出来，产生单链DNA分子(T链)，这些分子在其5'端共价连接到VirD2形成共价复合物(VirD2-T链)，紧接着与VirD5、VirE3、VirE2等蛋白结合形成T-DNA复合体，同时，VirD4与VirB形成T4SS-VirB/D4通道复合体，进而形成T4细胞通道，T复合体在VirF蛋白的辅助下通过T4细胞通道进入宿主细胞，在宿主细胞内发生分解，T链在VirD2的牵引下作为线性非置换片段进入宿主细胞核，整合到宿主基因组中，因此能在宿主中稳定存在和遗传[92]。 图 1 T-DNA转移机制 Figure 1 T-DNA transfer mechanism 注：在AS诱导下，膜蛋白VirA接受刺激，VirA蛋白结合物磷酸化virG基因，并转录激活Vir区，Vir区被激活转录出virD1、virD2、virB和virE等蛋白基团，VirD1和VirD2为核酸内切酶，并持续发挥作用，剪切T-DNA，在VirD1、VirD2、VirE2、VirB等蛋白作用下形成T-DNA复合体，多种蛋白互作进入宿主细胞核，最终整合到宿主基因组 Note: Under the induction of AS, the membrane protein VirA is stimulated, and the VirA protein conjugate phosphorylates the virG gene and transcriptionally activates the Vir region. The Vir region is activated to transcribe the protein groups such as virD1, virD2, virB and virE, and VirD1 and VirD2 are nucleic acid Dicer, and continue to work, shear T-DNA, under the action of VirD1, VirD2, VirE2, VirB and other proteins to form a T-DNA complex, multiple proteins interact with the host cell nucleus, and finally integrate into the host genome 图选项 1.2 ATMT操作流程ATMT操作过程中主要包括农杆菌诱导培养、共培养、转化子筛选3个部分(图 2)。农杆菌诱导培养：挑取含有双元载体的根癌农杆菌单菌落，添加AS避光诱导培养至指定浓度；黑曲霉(Aspergillus niger)与农杆菌诱导共培养：取适量A. niger孢子悬浮液和诱导过的农杆菌菌液充分混合，均匀涂布于诱导培养基平板上，避光正置培养，AS添加量、共培养膜基质、培养时间及温度视具体情况而定；转化子筛选：转膜至初筛培养基上进行转化子筛选并杀灭根癌农杆菌，提取转化子基因组并以之为模板进行PCR鉴定[46]。 图 2 ATMT流程图 Figure 2 Flowchart of ATMT 图选项 2 ATMT转化效率的影响因素及优化根癌农杆菌种类、AS浓度、双元载体种类、受体材料、共培养时间和温度等众多因素都会对转化效率产生显著影响[39, 41, 48, 60, 67, 72, 76]。需要在保证T-DNA转移的同时，兼顾转化材料的生长状况，重点对农杆菌和宿主材料的数量、生长时间及温度进行调控。 2.1 受体材料适宜的受体材料是转化成功的关键，一般选取幼嫩的组织或细胞，如新鲜或刚萌发的孢子、原生质体、渗透型敏感细胞等，更容易吸纳外源DNA。 ATMT适用范围广泛，成功对真菌分生孢子、菌丝体、原生质体、子实体等多种转化材料进行遗传转化[48, 54, 60]，但不同细胞结构对根癌农杆菌敏感度存在差异，双孢蘑菇(A. bisporus)菌褶作为受体材料比孢子获得更高的转化效率[24, 84]；金针菇菌丝体转化效率是原生质体的2倍[93]；而部分真菌只能实现特定材料的ATMT转化，毛霉菌和根霉菌的菌丝体、萌发和未萌发孢子、子实体均未能实现ATMT转化，仅在原生质体中获得成功[79, 92]。此外，受体材料的生长情况也会对转化效率产生极大影响，受体生长过快导致农杆菌侵染过程不完整，受体生长过慢，转化子获得率低且筛选困难。在实验中需对真菌产孢能力、孢子萌发情况和不同细胞结构生长速度等指标进行监测，优先对原生质体、孢子、幼嫩菌丝体进行ATMT预实验，确定最佳受体材料，并对受体材料的生长情况进行监控，建议每隔12 h进行监测，在根癌农杆菌增殖和受体细胞生长中寻找平衡，不使一方生长过快而影响转化效率，保证T-DNA转移过程完整，以获得更高的转化效率。 2.2 根癌农杆菌的种类根癌农杆菌在转化过程中起到承载、转移和整合目的片段的作用。实现高效侵染必须借助Ti质粒上Vir区编码的毒力蛋白，因此农杆菌毒力强弱决定了T-DNA转移能力的高低。目前可用于真菌ATMT转化的农杆菌有：AGL-1[62, 75, 94-95]、GV3101[55]、LBA4404[62]、LBA1101[80]、C58C1[71, 78]、EHA105[42, 94-95]、LBA1126[77]等。在实际研究中也发现不同农杆菌菌株转化效率存在差异，甚至少数根癌农杆菌不能转化真菌。Wang等[41]测试了4种农杆菌对高山被孢霉(Mortierellaoeae alpina)的转化效率，从高到低依次为AGL-1、EHA105、C58C1、LBA4404，并且LBA4404没有获得转化子。在众多真菌ATMT研究中，AGL-1菌株转化效率普遍偏高。对黑曲霉(A. niger)[94]和交织顶孢霉(Acremonium implicatum)[95]的转化效率分别是EHA105的12倍和600倍；在申克氏孢子菌丝(Sporothrix schenckii)的研究中发现AGL-1转化效率是EHA105的5倍，LBA4404的10倍[62]。但AGL-1不能介导斑玉蕈菌(Hypsizygus maculatus)的ATMT转化[96]。尽管如此，AGL-1相较于其他菌株适用范围更为广泛。研究过程中建议选择2–3种较高毒力菌株，如AGL-1、EHA105或GV3101进行对比转化，以确定最适宜的根癌农杆菌菌株。 2.3 双元系统、启动子及标记基因适宜的载体系统是实现转基因操作的桥梁，在转基因过程中起到承载目的片段和赋予宿主新基因功能的作用。Lacroix等[97]对野生型根癌农杆菌菌株进行了修饰，以适用于广泛多样的宿主为目标，使其能够应用于其他真核物种。在此基础上改造出适用于真菌转化的双元载体系统(二元系统)和共整合系统，除Ori序列等载体基本骨架外，均具备完整的Vir基因区、T-DNA及左右边界，以供核酸内切酶特异性识别并切割。双元载体由含有T-DNA的多功能克隆质粒和含有Vir区的Ti衍生质粒构成，均位于根癌农杆菌内，前者负责在大肠杆菌和根癌农杆菌内进行复制和运载T-DNA边界内的DNA序列(目的基因及标记基因)，后者提供反式毒性区功能，催动T-DNA的转移。共整合系统由同时含有转移区和毒力区的Ti质粒和大肠穿梭质粒构成，Ti质粒在根癌农杆菌内，穿梭质粒在大肠杆菌内，通过与大肠穿梭质粒发生同源重组将外源基因整合到Ti质粒的T-DNA区形成共整合质粒，使之成为T-DNA的一部分。 常用的双元载体有pBI-121[69]、pBNI19[72]、pGreen[72]、pCAMBIA[45, 86]系列等，通常以这几种载体为基本骨架通过更换启动子、更换抗性基因、重组进目的基因等方式构建出适用的双元载体。不同载体的转化效率差异明显，在双孢蘑菇(A. bisporus)菌的转化中，pCAMBIA载体的转化效率明显优于pBNI19和pGreen[72]。除常用骨架外，通常利用glaA、gpdA、cbh、trpC等启动子启动目的基因[40, 98]，并以潮霉素磷酸转移酶基因为标记基因，此外标记基因的启动子会对转化效率产生显著影响，在双孢蘑菇(A. bisporus)中，选用gpdA启动子的转化效率是trpC启动子的15倍，CaMV35S启动子没有转化成功[24]。然而，CaMV35S启动子成功驱动了rac基因在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)中的表达[99]。在设计表达载体时建议以通用型双元质粒做骨架，如pCAMBIA系列[19, 27, 29, 37, 94]或pBI-121[69]系列，此外建议选用glaA和gpdA等广谱型强启动子来驱动目的基因或标记基因。 2.4 诱导物浓度Shaw等[100]发现在virA和virG基因作用下根癌农杆菌对酚类化合物具有趋化性。后续发现，在对绝大部分真菌进行ATMT转化时需要AS的诱导[62, 83]。 在ATMT中，AS主要添加于共培养阶段和农杆菌预培养时期。共培养阶段的AS诱导对转化成功必不可少，在指状青霉的ATMT转化共培养阶段必须添加AS才能成功转化[67]。此外，AS浓度会对转化效率和插入拷贝数有直接影响，共培养中AS浓度通常为200−300 μmol/L[83, 101]。在黑曲霉(A. niger)的研究中，AS浓度为200 μmol/L时转化率最高，超过或低于这一浓度，转化效率均下降[102]。众多研究结果与此相近，即转化效率与AS浓度之间呈现出一种单峰型的线性关系。在一定浓度范围内，转化效率随着AS浓度的升高而增加，超过最适浓度后，转化效率没有明显增加甚至下降[52-53, 91-92]，这是因为过少的AS无法诱导vir基因表达，过多则会引起宿主T-DNA拷贝数增加，甚至导致根癌农杆菌中毒。目前预培养时期AS的添加与否对转化效率的影响评价不一。在转化炭疽病菌(Colletotrichum trifolii)[78]和外生菌根真菌(Hebeloma cylindrosporum)[103]的过程中是否进行根癌农杆菌AS预培养对转化效率没有明显影响。但在须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)[50]、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)[104]和球状白僵菌(Beauveria bassiana)[77]转化中进行AS预培养得到了更高的转化效率。建议通过AS浓度梯度测试(50、100、200、300、400 μmol/L)确定最适浓度，并进行根癌农杆菌AS预培养，预培养AS浓度与共培养阶段保持一致。 2.5 共培养温度和时间共培养温度对转化成功与否至关重要，温度过高，受体生长过快，导致农杆菌侵染不完全就已复苏为完整菌体，也会导致农杆菌生长过快，致毒素积累使T-DNA转移受阻，转化率极低或为零。温度过低，农杆菌生长缓慢，Vir毒力蛋白活力低下，孢子萌发率低，转化子数量少且阳性率不高。T-DNA转移适宜在低温条件下进行，根癌农杆菌最适生长温度为28 ℃，因此共培养温度在20–25 ℃时转化效率最高。如米曲霉(A. oryzae)[48]、巨大口蘑(Tricholoma giganteum)[42]、叶斑病菌(Curvularia lunata)[64]、指状青霉(Penicillium digitatum)[47]、日本曲霉(A. japonicus)[63]和须癣毛癣菌(T. mentagrophytes)[50]的ATMT转化中，最适温度分别为22、25、25、25、24、20 ℃，低于最适温度，转化效率随温度的升高而增加，超过则迅速下降。这与T-DNA切割、组装和转移的相关蛋白适宜于低温条件有关，高温易失活，导致转化率降低[105-106]。因此可通过低温共培养显著提高转化率，既能保证毒力蛋白正常发挥功能又能平衡宿主菌与根癌农杆菌的生长。 根癌农杆菌与易感材料接触36−48 h内导致细胞改变，完成外源DNA转移[107]，因此共培养时间一般为24−60 h，此外，在一定范围内，转化效率与共培养时间呈正相关，在巨大口蘑(T. giganteum)的遗传转化中，共培养时间低于36 h时，转化效率随时间延长而增加，36 h时获得最高转化率，延长时间至60 h时转化率逐渐下降，至84 h时，转化率极速下降40%[42]。少数转化的共培养时间需要72−192 h[11, 36, 48]。这与宿主菌生长特性有关，以孢子、原生质体等作为受体材料共培养时间较短，以子实体、菌丝体等作为受体材料则转化时间较长[24, 84, 93]。在实际转化中可通过共培养温度梯度测试(20−28 ℃)和时间梯度测试(24、36、40、48、56、64、80 h)获得最佳共培养条件。 2.6 受体材料数量与农杆菌浓度比例适宜的受体细胞和根癌农杆菌浓度比可以获得更多单拷贝转化子及更高转化效率。受体材料或根癌农杆菌浓度低，导致转化子数量稀少或为零，假阳性率高。受体或农杆菌过多，真菌生长容易连片，农杆菌生长过快影响受体材料萌发，转化子挑取困难[11-12, 51, 53, 59, 76]。 共培养的关键参数不仅包括细菌细胞与受体细胞之间的比例，还涉及侵染期间混合物的密度。只有农杆菌OD600值为0.2−0.3，孢子浓度为106个/mL时才能对淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)进行ATMT转化，高出或低于该浓度均未成功[70]。较高浓度的根癌农杆菌和真菌细胞可以提高转化效率，但最高浓度有一定界限，在此浓度范围内，转化率随着农杆菌数的增加而递增，这一现象在尖曲霉(A. aculeatus)[60]、灵芝(Ganoderma lucidum)和糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)[108]的ATMT转化中均有体现，此外受体材料与根癌农杆菌的数量比分别保持在1:10 000、1:1 000、1:100时转化效率最高。建议控制根癌农杆菌与受体细胞数量比值在100−10 000之间进行转化。 2.7 其他因素影响ATMT转化效率的因素还包括共培养膜基质、培养基pH值、氧气含量、选择标记和根癌农杆菌杀灭剂等。 目前真菌ATMT转化中常使用硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、纤维滤纸、玻璃纸、醋酸纤维膜、醋酸硝酸混合膜等作为共培养基质。不同膜基质之间转化率差异较大，黑曲霉(A. niger)中不同基质转化效率排序从高到低为：硝酸纤维素滤膜、醋酸硝酸混合膜、醋酸纤维膜、尼龙膜[53]；荸荠秆枯病菌中不同共培养基质转化效率从高到低排序为：硝酸纤维素膜、Hybond N+膜、玻璃纸、滤纸[11]；烟曲霉中尼龙和纤维素滤膜的转化率最高，硝化纤维素膜效果最差[76]；指状青霉(P. digitatum)中滤纸转化效率是可米拉布膜的2倍[47]；致病疫霉(Phytophthora infestans)中Hybond N+杂交膜转化效率是尼龙膜的2−3倍[80]。此外以玻璃纸为共培养基质分别成功转化了P. infestans[56]、哈茨木霉(T. harzianum)[58]、黑曲霉(A. niger)[46]。以上结果表明，不同膜基质会对转化效率产生一定的影响，这与膜材料渗透能力和化学性质相关，膜的化学性质可能影响根癌农杆菌细胞和分生孢子的分布并抑制其相互作用，建议选择硝酸纤维素膜作为共培养基质。 酸性环境更有利于真菌ATMT转化。炭疽病菌(C. gloeosporioides)[81]和里氏木霉(T. reesei)[12]的ATMT转化最适pH值为5.3，高于或低于这一数值都会导致转化率降低。在蛹虫草(C. militaris)中pH值5.5时转化效率最高，pH值稍高或略低于5.5，转化率都明显下降[65]。综合其他研究结果，建议共培养培养基pH为5.0−5.6之间[11, 78]。 溶氧量、标记基因和农杆菌杀灭剂是ATMT转化中很容易忽略的因素。随着诱导过程中溶氧量的增加，转化效率呈上升趋势[53]，这与根癌农杆菌代谢水平增强、细胞活力增加使毒力蛋白分泌量增加有关[77]。适宜地选择标记对转化子的筛选尤为重要，除少数使用营养缺陷型进行筛选外，多采用潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin B Phosphotransferase)基因作为标记基因，此外不同菌种对潮霉素的敏感度差异较大，需对宿主菌进行抗生素敏感度测试，找到最低抑制浓度。头孢噻肟是ATMT转化过程中常用的根癌农杆菌杀灭剂，对真菌没有抑制作用，通常在筛选培养基中添加200−300 μmol/L的头孢噻肟对农杆菌进行杀灭，防止其继续生长覆盖转化子。 3 ATMT在真菌疾病研究中的应用病原真菌是指寄生于动植物体表或体内导致动植物病害的真菌。真菌性植物病害达30 000余种，占植物病害的70%−80%，其中炭疽病菌和枯萎病菌占比较大[109-110]。动物性病原真菌通过侵染人体及动物体浅表组织或入侵内部器官引起扩散性深层病害。ATMT为瓜类炭疽病[81]、荸荠秆枯病[11]，玉米弯孢菌叶斑病[64]、稻瘟病[15, 19]、角膜炎[32]、孢子丝菌病[62]等数十种动植物疾病机理研究和耐药基因发掘提供技术支持(表 2)。 表 2 根癌农杆菌介导的真菌性疾病的研究 Table 2 Functional analyses on mycosis by ATMT 真菌疾病Mycosis 病原真菌Pathogenic fungus 主要感染物种Major infectious species 文献来源Literature sources Rice blast Magnaporthe grisea Oryza sativa L., Triticum aestivum L., Hordeum vulgare L. [15, 19] Fusarium graminearum Fusarium graminearum Schw Oryza sativa L., Triticum aestivum L., Hordeum vulgare L., Avena sativa L. [13] Gloeosporium theae-sinensis miyake Colletotrichum gloeosporioides Camellia sinensis [43] Cucurbits anthracnose Colletotrichum lagenarium Cucurbitaceous plant [81] Stylo anthracnose Colletotrichum glloeosporioidesColletotrichum damatium Stylosanthesguianensis [59] Anthracnose of alfalfa Colletotrichum destructivumColletotrichum trifolii Medicago Sativa Linn [78] Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans Fusarium oxysporum Brassica oleracea L., Brassicaoleracea L. var. italica Plenck [32] Apple tree canker Valsa mali Malus domestica Stem blight of water chestnut Cylindrosporium eleocharidis Eleocharis dulcis [11] Green mold Penicillium digitatum Citrus reticulata Blanco [51] Sclerotium rolfsii Sclerotium rolfsii Camellia oleifera Abel, Vernicia fordii, Catalpa bungei, Citrus reticulata Blanco, Malus domestica, Firmiana platanifolia [44] Flax rust Melampsora lini Linum usitatissimum L. [21] White rot Phanerochaete chrysosporium Vitis vinifera [71] Potato late blight Phytophthora infestans Solanum tuberosum [56, 80] Pine resin canker Fusarium circinatum Pinus [85] Maize curvularia leaf spot Curvularia lunata Zea mays L. [64] Fungal keratitis Fusarium oxysporum Homo [32] Pityrosporum folliculitis Malassezia furfur Homo [49] Sporotrichosis Sporothrix schenckii Homo [62] 表选项研究者们借助ATMT转化绿色荧光蛋白(Green Fluroscent Protein，GFP)等报告基因，通过观察荧光信号进而监测细胞核分裂运动及病原真菌调控蛋白的移动，或构建突变体库进行高通量基因型和表型的筛选，利用Tail-PCR进行T-DNA标记，筛选出致病位点，达到研究致病真菌侵染途径和定殖机理的目的。Guo等[19]通过ATMT将eGFP基因靶向整合到Maynaporthe oryzae基因Mosdi-R位点，证明对Mosdi1位点进行靶向整合是稻瘟病遗传互补分析的有效方法；对茶树炭疽病原菌进行GFP荧光标记，发现胶孢炭疽菌的分生孢子可以在叶片的气孔和叶片组织内定殖[43]；通过构建以GFP为报告基因的荸荠秆枯病病原菌T-DNA插入突变体库，获得表型和致病性缺陷突变体，为荸荠秆枯病菌基因功能和病菌与寄主互作研究提供了参考依据。 4 ATMT介导外源蛋白在真菌中的表达丝状真菌、酵母菌和食用菌为代表的大部分真菌具有蛋白分泌能力旺盛、安全性高、生长繁殖迅速、发酵工艺简单等优点，它们作为优良的工程菌，被广泛运用到外源蛋白的高效表达。采用ATMT技术在海洋黑曲霉(A. niger)中定向表达了6种纤维素酶组分(AnCel6、AnCel7A、AnCel7B、Aneg1、AnBGL1和AnBGL2)，通过酶学性质研究，解释了其分泌的纤维素酶混合物的耐盐性机制[45]。凭此技术在金针菇中稳定表达了乙型肝炎病毒表面抗原(HbsAg)[111]，此外还介导了大量异源蛋白和同源蛋白的高效表达，如脂肪酶、β-葡萄糖苷酶、抗原蛋白等(表 3)。 表 3 ATMT介导外源蛋白的表达 Table 3 Expression of exogenous proteins in fungi mediated by the ATMT 外源基因Exogenous genes 受体Hosts 双元载体Binary vector 参考文献References eGFP Macrocybe gigantea Plasmid4 [42] GFP Cylindrosporium eleocharidis pEX4 [11] GFP Colletotrichun gloeosporioides PSK2251 [43] DsRed, TdTomato, GUSPlus Sclerotium rolfsii − [44] Lipase of Rhizopus chinensis Aspergillus niger pCAMBIA1301 [46] HBsAg Hepatitis B virus surfaceantigen encoding gene Flammulina velutipes p0390-AiH-FmHB [111] Halophilic, eosinophilic β-glucosidase Marine Aspergillus niger pCAMBIA [45] VgbVitreoscilla hemoglobin Lentinus edodes pBHg-vgb-gpd [112] DsRed, GFP Penicillium digitatum pPK2 [47] eGFP, β-glucuronidase Morchella esculenta p1391-U-GUS [30] eGFP, β-glucuronidase Agaricus bisporus pYN6981 [16] DsRed Aspergillus oryzae pEX2 [48] eGFP Harpophora oryzae pKOHo [52] Cellulase Trichoderma reesei pCAMBIA1300-hph-PsCT [12] P. ostreatus hydrophobin Tremella fuciformis pGEH-GH [113] eGFP Cladonia metacorallifera pCAMBIA1300 [54] Enterovirus 71 structural protein P1and protease3C Flammulina velutipes p0390-AiH-VLP [114] eGFP Colletotrichum glloeosporioides Pens pCAMBIAl300 [59] Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, eGFP Ganoderma lucidum pCAMBIA1300 [29] eGFP Blastocladiella emersonii pBINPLUS [61] DsRed, GFP Glomus intraradices pNHFoxdsRedstuApNHATPdsRedstA [68] Spruce budworm antifreeze protein Volvariella volvacea pLin235 [26] Chitinase of Metarhizium anisopliae, GFP Paecilomyces lilacinus pCAMBIA1302 [70] β-glucuronidase, GFP Phanerochaete chrysosporium pCAMBIA [71] chitinase of Bacillus subtilis Trichoderma viride − [73] GFP Colletotrichum gloeosporioides pDHt, pJF1 [75] Polyketide synthase Aspergillus fumigatus pdht-hphpdht-sk [76] β-glucuronidase Phytophthora infestans pNptII [80] GFP Monascus purpureus pUR5750, pBGgHg [17] eGFP Suillus bovinus pBGgHg [83] eGFP Agaricus bisporus pCAMBIA1300 [24] 注：−：未报道 Note: −: No reference 表选项 5 总结与展望1995年ATMT首次应用到酿酒酵母中，此后便在真菌遗传研究中广泛运用，由最初的1–6种宿主真菌发展到担子菌门、子囊菌门、壶菌门、接合菌门等百余种真菌。本文综述了ATMT的研究进程、技术优缺点、转化机制和应用现状，反映了该技术在真菌基因资源开发、病原真菌研究、真菌基因组学等方面的巨大潜力。 然而ATMT仍然存在不足：(1) ATMT在真菌中的应用不完全成熟。农杆菌种类、共培养温度及时间等众多因素都会对转化效率产生影响，不同菌株甚至同一菌株不同受体材料之间转化效率差异较大，限制了该技术的推广使用；(2) ATMT在构建T-DNA突变体库中存在局限性。T-DNA插入的拷贝数不定，存在单拷贝和多拷贝串联排列现象，整合位点的特异性也尚未明确，此外引入了左右边界两端约25 bp的重复序列，对于定点突变和侧翼序列的鉴定产生阻碍；(3) T-DNA整合机制尚不清楚。T-DNA进入宿主细胞后在VirD2蛋白的牵引下以尚不清楚的方式整合到宿主基因组中；(4) 目前关于ATMT的报道较为单一，多为转化条件的优化，对于整合机制的研究较少，缺乏相关基因的功能研究。 尽管如此，ATMT仍然是真菌遗传研究中强有力的分子手段，它使众多难以进行遗传转化的真菌的研究成为可能，由于具有更高的同源重组频率和T-DNA单拷贝插入率，在真菌基因突变体库构建方面具有很好的应用价值。有报道利用ATMT在金针菇中成功进行了CRISPR/Cas 9基因编辑系统的研究，该技术介导真菌CRISPR/Cas 9系统的开发将是热点，将会为真菌领域基因编辑系统的开发与应用提供强有力支持。 |
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