膀胱癌（BC）是一种常见的泌尿道上皮恶性肿瘤，其特点是复发率高。膀胱癌的生物学是复杂的，需要破译。最新证据揭示了非编码 RNA，尤其是 microRNA (miRNA) 作为癌症中重要调控元件的关键作用。

方法

我们使用配对组织（肿瘤和邻近的正常膀胱组织）进行了 miRNA 微阵列，然后对五个选定的转录本进行了 qRT-PCR 验证。额外的下一代测序研究建立了改变的 miRNA 和突变基因之间的相互联系。基于 TCGA 数据与研究中获得的数据之间的重叠，我们着重于系统鉴定参与膀胱癌肿瘤发生和进展的改变的 miRNA 和突变的基因。

结果

通过重叠两个患者队列的 miRNA 表达数据，我们确定了 18 个 miRNA 下调和 187 个 miRNA 上调。qRT-PCR 验证是使用一组选定的两个下调（miR-139-5p 和 miR-143-5p）和三个上调 miRNA（miR-141b、miR-200 s 或 miR-205）完成的。改变的 miRNA 模式与膀胱肿瘤发生相互关联，使它们可用于开发新型诊断和预后生物标志物。三种与 EMT 相关的上调 miRNA 在分子机制中具有重要作用，特别是肿瘤发生、侵袭和转移的关键过程。使用 Ampliseq Cancer Panel 试剂盒和 Ion Torrent PGM 下一代测序提高TP53、FGFR3、KDR、PIK3CA和ATM的突变率被观察到，但只有 TP53 的突变状态与存活率相关。miRNA 模式以及获得的基因突变模式可以帮助更好地诊断患者。

结论

因此，这项研究将 miRNA 作为膀胱癌预后的关键参与者，其中它们改变的基因表达谱具有与肿瘤分子表型相关的关键生物学功能。在 BC 中确定的 miRNA-mRNA 调控网络已经成熟，可以用作生物标志物或靶向治疗策略。

Keywords:膀胱癌, miRNA, 突变, miRNA-mRNA网络

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背景

膀胱癌 (BC) 是泌尿道的一个全球性问题，在死亡率和发病率方面统计上排在第五位 [ 1 ]。BC 发病率在老年人群中较高，并且与有毒环境因素相关，尤其是与吸烟相关 [ 2 ]。BC 的预后不良，无论治疗如何，疾病复发率都很高；这些治疗包括手术、化学疗法或这两者的组合 [ 1 ]。大约 70–75%的BC 病例被定义为非肌肉浸润性肿瘤，可细分为低级别或高级肿瘤 [ 3-5 ]。高危肿瘤的鉴定势在必行，需要将膀胱内治疗作为标准做法 [ 6]].

BC 是一种多因素疾病，其中外源性和内源性因素在早期癌变、疾病进展中都是必不可少的，但也导致高复发率，与特定的突变模式相关 [7 ]。因此，迫切需要用于膀胱癌早期诊断的新生物标志物、用于其复发的预后标志物以及用于反应/总生存期的预测标志物 [8 ]。分子标记物可以提供重要信息以改进最佳治疗，从而使患者获得良好的预后 [ 5 ]。

微小 RNA (miRNA) 是一类新型的短非编码 RNA 序列，其长度约为 19–25 个核苷酸 [ 8、9 ]。这些短的非编码结构可以调节基因表达并干扰重要的细胞通路而不被翻译成蛋白质，包括在癌症生物学中。一个 miRNA 可以靶向多个基因，多个 miRNA 可以靶向一个基因，这就产生了复杂的相互作用网络；目前，尚未确定确切的相互作用，尤其是与突变状态的关系[ 8、10]. 因此，由于其致癌或抑癌功能，miRNA 是诊断和预后的重要候选者。因此，来自不同组织的 miRNA 分析研究代表了这些短序列作为具有临床意义的生物标志物的极好替代应用 [ 11 ]。主要优点是这些转录本的高稳定性，在手术切除过程(TURB) 期间保持不变，这通常与高降解率相关 [ 12、13 ]。另一个优势是用于 miRNA 分析（微阵列、下一代测序或纳米串）或验证（qRT-PCR 或原位杂交）的全套工具和方法 [8 ]。

以前的研究已经检查了 BC 中的 miRNA；然而，很少有案例通过微阵列检查配对样本中的全局 miRNA 表达模式，随后使用 TCGA miRNA 数据进行重叠。我们利用这个组合数据集来识别与 BC 相关的特定途径。在对膀胱癌样本进行分析后，我们使用 Ion Torrent 下一代测序癌症面板来确定我们的患者队列和 TCGA 数据集中最相关的突变。这些数据的相关性允许更好地理解相互关联的调控网络，这些调控网络在肿瘤分子表型和基因表达谱方面似乎具有重要的生物学意义；所有这些都将被用作未来疗法的候选者或预后/诊断生物标志物。

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材料与方法

样品采集

2014 年至 2016 年间，我们仅在获得每位患者的知情同意并获得罗马尼亚克卢日纳波卡 Iuliu Hatieganu 医药大学机构伦理委员会的批准后，才从患者那里收集了肿瘤 BC 组织以及邻近的健康组织（UMPh），授权号。673A/2012 年 11 月 20 日。我们将经尿道膀胱肿瘤切除术 (TURBT) 组织保存在液氮中，直至样品处理和 RNA 提取。在手术和病理程序允许的情况下，外科医生从每位患者身上收集与肿瘤相邻的健康组织。我们最初使用标准免疫组织化学染色方案评估了 Her2 和 TP53 的表达。后来用于微阵列和下一代测序分析的配对（健康和肿瘤）组织样本被称为 UMPh 患者队列。第二组采集样本用于qRT-PCR验证，命名为验证集；我们收集了这个额外的患者队列。

样品处理和微阵列评估

使用 TriReagent (Sigma-Aldrich) 方案从 23 个配对样本（正常和肿瘤膀胱组织）中提取和分离总 RNA。NanoDrop-1000分光光度计用于测定RNA浓度。通过使用基于 2015 年 9 月 3.1 版（安捷伦科技）的 miRNA 微阵列方案，从等量的 100 ng 总 RNA 合成微阵列探针，其中包括完整的标记和杂交试剂盒（目录号 5190-0456 安捷伦）和纯化步骤与 Micro Bio-Spin P-6 凝胶柱 (Biorad)。SureScan 微阵列扫描仪（安捷伦科技）扫描微阵列载玻片，特征提取 12.0 软件执行数据提取。微阵列评估的最后一步是识别主要改变的 miRNA。Gene Spring GX v.13.0，p值≤0.05），分析了微阵列数据并生成了低级别与高级肿瘤组织的比较；低级别肿瘤与健康组织；高级肿瘤与健康组织（Arrayexpress 上提供的数据，ID：E-MTAB-8356）。

膀胱癌TCGA数据分析

我们对来自 TCGA 数据门户 ( https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/ ) 的 409 个膀胱肿瘤和肿瘤附近的 19 个健康组织进行了第三级 miRNA 测序的补充分析。). 数据在 GeneSpring GX v.13.0 中分析，应用先前定义的截止值。

组织样本的 miRNA qRT-PCR 评估

我们选择验证配对组织样本中的三个上调转录本（miR-23a、miR-141-3p 和 miR-205-5p）和两个下调转录本（miR-139-5p 和 miR-143-5p）。使用基于 TriReagent 的方法提取 RNA，对 18 个健康膀胱组织和 18 个膀胱肿瘤组织进行 qRT-PCR 验证。我们使用含有 0.72 μl RT 引物、50 ng 总 RNA 和 0.5 μl MultiScribe 逆转录酶、0.75 μl 逆转录缓冲液 (10×)、0.075 μl dNTP (100 mM) 的 7.5 μl 逆转录混合物进行 cDNA 合成, 0.1 μl 核糖核酸酶抑制剂，根据 Taqman MicroRNA 逆转录试剂盒 (Applied Biosystems) 方案。cDNA 混合物在 PCR 管中在 16°C 下孵育 30 分钟，在 42°C 下孵育 30 分钟，在 85°C 下孵育 5 分钟。使用in ViiA7 (Applied Biosystems) PCR仪进行qRT-PCR，总反应混合物体积为12.5 μl；该反应混合物包含 6.25 μl cDNA（用无核酸酶水按 1:6 稀释）、5.63 μl SSoAdvanced Universal Probe Supermix (Bio-Rad) 和每个 miRNA 的 0.73 μl 引物。反应设置如下：初始变性步骤在 95 °C 下持续 180 秒，然后是 95 °C 持续 5 秒的 39 个循环，最后是 60 °C 持续 30 秒。每个miRNA的表达水平通过阈值循环计算（C 随后是 95 °C 5 s 的 39 个循环，最后是 60 °C 30 s。每个miRNA的表达水平通过阈值循环计算（C 随后是 95 °C 5 s 的 39 个循环，最后是 60 °C 30 s。每个miRNA的表达水平通过阈值循环计算（C吨）。使用–ΔΔC T方法和用于归一化的U6计算相对表达水平。

通过 qRT-PCR 对膀胱组织样本进行 TP53 评估

实验室技术人员使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒 (Applied Biosystems) 合成了 cDNA。qRT-qPCR 的反应制备使用 SYBR Select Master Mix (Life Technologies) 并使用 ViiA7 执行。使用以下条件：95°C 2 分钟，40 个 95°C 10 秒和 60°C 1 分钟的循环。以B2M为管家基因，用ΔΔC T法计算基因表达的FC 。

膀胱癌样本的下一代测序

使用 Ion Ampliseq Cancer Panel 和 Ion Torrent PGM Next Generation Sequencing (Thermo Fischer Scientific) 对许多 22 个膀胱癌样本进行测序，这些样本与微阵列分析的相同（除了来自微阵列患者队列的低 DNA 浓度样本）；该面板包含最相关的热点突变。使用 20 ng DNA 和 Ion Ampliseq™ Library Kit 2.0 (Life Technologies) 制备扩增子文库，然后使用 AMpure XP Beads (Beckman Coulter) 进行纯化步骤。最后，使用 Qubit HS DNA 试剂盒使用 Qubit 2.0 进行定量。对于测序，每个 Ion 316 芯片（Thermo Fischer Scientific）使用四个条形码 100pM 稀释文库。Ion Torrent PGM Machine (Thermo Fischer Scientific) 使用 Ion PGM HI-Q Sequencing 200 套件进行测序。

功能分析和靶基因鉴定

IPA 分析确定了表达水平改变的 miRNA，以识别最相关的网络、改变的途径及其各自的生物学意义。为了识别与我们的 miRNA 最相关的靶基因，使用了以下数据库和网络服务器：miRTarBase ( https://bio.tools/mirtarbase )；miRNet ( https://www.mirnet.ca/ )；和 miRtargetLink ( https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/mirtargetlink/ )。

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结果

膀胱癌患者统计

我们使用 WHO-2016 分类和最常见的组织学类型尿路上皮癌确定了初始 miRNA 分析。更具体地说，对于微阵列研究，患者的样本被分级为低或高，此外，通过免疫组织化学 (IHC)，确定了Her2和TP53的表达水平。数字 1个举例说明了TP53和Her2的低等级阴性染色病例与 TP53 和 Her2 的高等级阳性染色病例相比。

图。1

使用标准免疫组织化学染色方案（放大 400 倍）在低级别和高级别膀胱肿瘤样本中表达Her2和TP53

桌子 1个介绍了为微阵列选择的人口统计数据和患者特征。在微阵列队列中包括的 23 名患者中，平均年龄为 64.04 ± 11.72，包括 5 名平均年龄为 56.80 ± 6.30 的女性和 18 名平均年龄为 66.05 ± 12.20 的男性。18 名患者（5 名女性和 13 名男性）的 qRT-PCR 队列的平均年龄分别为 66 ± 9,59（女性为 57,2 ± 7,98，男性分别为 69,38 ± 8.03），这可以见表 2个. 我们将选择用于分析和 qRT-PCR 验证的患者队列分为两个主要亚型：低级别非侵入性肿瘤和高级晚期肿瘤。

表格1用于 miRNA 微阵列评估的 23 名参与者的人口统计学和组织病理学特征

表 2用于 qRT-PCR 数据验证的 18 名参与者的人口统计学和组织病理学特征

评估膀胱癌患者的组织 miRNA 模式

目前的分析研究使用安捷伦 60 聚体 SurePrint 微阵列技术，该技术包含捕获探针来表征 2549 种成熟人类 miRNA 的表达，这些 miRNA 从注释的 miRbase 16 中获得。这种分析研究导致基于分析识别最相关的改变的 miRNA配对样本：膀胱癌肿瘤组织 (TT) 与邻近健康组织 (TN)。它在 UMPh 患者队列中确定了 8 个下调和 28 个上调的 miRNA（附加文件1：表 S1）。热图分析显示了 UMPh 患者队列的肿瘤组织中改变的 miRNA，如图 1 所示。 2个A; 蓝色表示下调，而红色表示过度表达。

图 2

膀胱癌中 miRNA 的组织特异性特征。miRNA热图强调了 409 个肿瘤组织与 19 个取自 TCGA 膀胱癌患者队列的健康组织中 miRNA 特征的改变。b miRNA 热图突出显示了比较肿瘤与健康组织时修改后的 miRNA 模式，代表来自 UMPh 患者队列的 23 对膀胱组织。c通过重叠 UMPh 和 TCGA 患者队列统计确定的（FC ± 2 和p值≤0.05）上调和下调 miRNA 表达的维恩图；d来自统计确定的 UMPh 和 TCGA 患者队列的维恩图（FC ± 2 和p-值≤0.05) 在高级肿瘤与健康组织中表现出上调和下调的 miRNA 表达

为了加强和提高 miRNA 分析研究的准确性，我们对 409 个肿瘤和 19 个肿瘤邻近的健康组织进行了额外的 TCGA 分析（附加文件2：表 S2）。该分析的截止值为 FC ± 2 和p值≤0.05，从中识别出 18 个下调和 187 个上调的 miRNA（附加文件3：表 S3）。该数据的热图如图 1 所示。的图 2b。2个b. 我们重叠了从上述两个数据集中获得的 miRNA 分析数据。维恩图如图 1 所示。的图2c2个c 显示 14 个上调和 4 个下调的 miRNA。对于高级别和低级别膀胱癌的分析（UMPh：附加文件4：表 S4；TCGA：附加文件5：表 S5），仅确定了一个共性，即 miR-10a 的下调（图 1）。的（图22个d).

给定图 1 中显示的信息的上下文。 3个，根据从我们配对的膀胱组织样本中获得的具有统计学意义的 FC 和以下标准，选择了五个 miRNA 用于进一步验证：两个最下调的 miRNA（miR-143 和 miR-139）；研究较少的与 EMT 相关的高度上调的 miRNA（miR-141 和 miR-205）；和一种中间上调的 miRNA (miR-23a)。

图 3

根据膀胱癌的 TCGA 数据确定的相应 miRNA 表达水平。a基于 TCGA 数据的五个选定的改变的 miRNA 转录本的表达水平显示为海盗图。b根据 TCGA 数据，膀胱癌中每个选定的 miRNA 转录本的 Kaplan-Meier 生存曲线；c所选五个 miRNA 转录本组合的 Kaplan–Meier 生存曲线（* p  ≤ 0.05，** p  ≤ 0.01，*** P  ≤ 0.001，Ns：无统计学意义，p > 0.05）。d使用 miRtargetLink 生成的选定 miRNA 转录本和基因之间的网络互连（https://ccb-web.cs.uni-saarland.de/mirtargetlink/ )

数字 3个a 显示了使用 TCGA 数据为五个选定的 miRNA（过表达的转录物：miR-23a、miR-141 和 miR-205；下调的转录物：miR-139 和 miR-143）生成的 Pirate 图。每个 miRNA 转录本的相关生存曲线见图 1。的图3b3个b 而图。的图3c3个c 显示了两种 miRNA 组合的生存曲线。我们观察到以下三种情况的总体生存率更高： miR-141 高表达 ( p  = 0.0045)；miR-143 的低表达 ( p  = 0.0184)；miR-143 的低表达与 miR-141 的高表达相结合 ( p  = 0.0163)。这些改变的 miRNA 通过调节细胞凋亡或侵袭相关基因的关键基因直接相互连接，正如使用 miRtargetlink 生成的网络所强调的那样（图 1）。的（图33个d).

qRT-PCR 数据验证

qRT-PCR 是验证微阵列数据的最相关和标准化的方法之一。用于 qRT-PCR 的新患者队列由 18 个健康组织和 18 个肿瘤组织组成。从 UMPh 患者队列和 TCGA 数据之间的常见 miRNA 列表中，我们选择了两个下调的（miR-139-5p 和 miR-143-5p）和三个上调的（miR-23a-3p、miR-141-3p、和 miR-205-5p) 作为独立的预后标志物进行验证。对于 miRNA 标准化，ΔΔCt 方法以 U6 作为参考/标准化；新的额外患者队列的 qRT-PCR 验证数据如图 1 所示。 4个A。构建 ROC 曲线以估计这些转录物作为膀胱癌生物标志物的敏感性和特异性，最高 AUC 值是 miR-141 (0.8599) 和 miR-205 (0.8865)。Circos 图见图 1。的图4b4个b 并进行了以下观察：miR-205-5p 和 miR-141-3p 非常异质，提供表达水平值，应将其视为可能的生物标志物。miR-143-5p 和 miR-139-5p 非常同质，提供作为生物标志物的潜在优势；正如我们预期的那样，对于我们相对中间表达的上调 microRNA，miR-23a 位于前面提到的 miRNA 之间。

图 4

qRT-PCR 数据验证。Pirate Plots 的左图显示了由健康（n  = 18) 和肿瘤组织 ( n  = 18)。使用基于 ΔΔC t方法的 U6 对数据进行归一化（* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001）。右图显示了每个选定 miRNA 的特异性和敏感性的 ROC 曲线（ROC：接受者操作特征，AUC：ROC 曲线下面积）。b Circos 图表示新患者队列的肿瘤组织中经过验证的 miRNA 转录本的表达水平

突变特征是膀胱癌组织的特征

我们分析了 22 名诊断为膀胱癌患者的 UMPh 队列中肿瘤组织的突变模式（附加文件9：表 S6）。TP53、FGFR3、KDR、PIK3CA和ATM的突变率增加。数字 5个a 表示每个基因中识别出的突变数量；同时，图 5个b 显示分析样本中每个基因的突变频率。使用 NCBI ClinVar 或 FATHMM，根据致病性对表现出的突变进行分类，即致病性、良性/非致病性或不适用/未知 (NA)（图 1）。的（图 5c）。5个C）。根据 ClinVar 分类，很大一部分突变被归类为未知 (NA) 作用 (55%)，7% 是致病性的。相比之下，使用 FATHMM 评分，52% 的突变被归类为未知 (NA)，而 37% 的突变被归类为致病性（图 1）。的（图5d）。5个d). 膀胱癌中的突变基因具有内含子和外显子定位。最相关基因（ATM、FGFR3、KDR、TP53和PIK3CA）的突变定位如图 1 所示。的图 5e。5个e. 对于TP53的情况，观察到表达TP53野生型的患者与表达突变体的患者相比存活率增加；对于其余的频繁突变基因，没有统计上显着的数据。我们显示的模式中的突变频率与来自 TCGA 的 200 例膀胱癌病例中的频繁突变一致；OncoGrid 总结了 200 个突变最多的膀胱癌病例和前 50 个突变基因。从 TGCA 数据和获得的频繁突变基因，可以看出表达突变和野生型基因的患者的总体存活率附加文件 6：图 S1。未观察到存活率与突变状态之间存在统计学显着相关性AKT、ATM、CTNNB1、FGFR3、TP53、KIT、MET、PIK3CA和SMO。

图 5

使用 Ion Ampliseq Cancer panel 试剂盒评估膀胱癌患者的突变模式。Ion Ampliseq Cancer 试剂盒中每个基因的突变数量条形图；b来自分析的 UMPh 患者样本的 Ion Torrent Cancer 面板中每个基因突变频率的条形图；c根据 ClinVar 分类按致病性分离的已鉴定突变饼图；d根据 FATHMM 评分和分类按致病性分离的已识别突变饼图；e膀胱癌患者中最常见突变基因的每个基因序列中的突变定位；FqRT-PCR评估TP53基因在所有健康组织（n  =41）和膀胱肿瘤组织（n  =41）中的表达水平；这个队列是指来自 UMPh 患者队列的 23 个样本和来自验证集的 18 个样本。g野生型和 TP53 突变样本中 TP53 表达水平的海盗图；h基于来自 UMPh 患者队列的 TP53 突变基因突变状态的总生存率的 Kaplan-Meier 曲线；i基于来自 UMPh 患者队列的 TP53 表达水平的总生存率的 Kaplan-Meier 曲线

使用 qRT-PCR 评估 TP53 表达

基因表达量FC的计算采用ΔΔC T法，B2M作为管家基因（图1）。的（图5f）。5个F）。数字的图5f5个f 表示比较膀胱肿瘤和正常组织时 TP53 的相对表达水平。TP53 的表达水平与其状态之间没有相关性（图 1）。的（图 5g）。5个G）。TP53 表达水平的附加图表使用中值截止值（高于或低 50%）将表达水平分为高或低和 TP53 突变状态，见图 1。的图5e5个e 或基于表达水平（图 1）。的（图 5i）。5个我）。我们观察到 TP53 野生型患者与突变型 TP53 相比存活率有所提高 ( p  = 0.0091)。

鉴定与膀胱癌肿瘤发生相关的 miRNA 功能通路

将表达水平改变的 miRNA 输入到专用软件 IPA（Ingenuity Pathways Analysis）中。该分析基于膀胱癌患者的 miRNA 特征以及与靶基因的相互联系，突出了指示疾病或生物学功能的主要改变网络。因此，如表中所示，确定了 9 个与膀胱癌相关的分子网络 3个. 此外，表 4个显示具有统计学意义的生物学、细胞和分子功能以及与这些改变的 miRNA 相关的疾病。这种统计相关性基于给定网络内改变的分子数量。表中的数据的表44个用于使用 IPA 生成分子网络的图形表示，它显示膀胱癌中改变的 miRNA 的节点基因。这提高了对 miRNA 基因相互作用的识别，并确定它们的性质是直接的还是间接的。数字 6个a 在改变的 miRNA 和靶基因之间的联系方面呈现了最重要的网络的重叠。改变的 miRNA 靶基因对调节肿瘤进展和细胞命运至关重要，对患者预后尤为重要。这再次强调了未发现的基因TP53、AKT、RAS、CDKN2A或CDK2作为重要调节因子与细胞命运的联系。这些基因与已验证的 miRNA 相互关联，用红色圆圈突出显示。致癌作用的另一个重要机制是从上皮到间充质 (EMT) 表型的转变（图 1）。 6个b). 确定AKT与与 miR-205-5p、miR-141-3p 和 miR-200b-3p 相互作用的ZEB2直接相关。这些 miRNA 具有最高的表达水平，提取自两个患者队列的最高改变转录本（在 TCGA 和我们的实验数据中发现）。因此，鉴定了参与致癌作用或导致细胞凋亡抗性的基因。这些基因被认为在结直肠癌 ( RAS )中具有预后作用或与膀胱癌 ( AKT )的进展相关。RAS和AKT已被证明与 miR-21 相关。数字的图6c6个c 根据包括 IPA 在内的文献信息，突出显示与炎症相关的相关转录本。

表3改变的网络基于膀胱癌参与者的 miRNA 特征，其中相关性分数是使用 IPA 生成的。每个网络都将 miRNA 与最相关的目标基因整合在一起，指示疾病或生物学功能，并据此计算分数

表 4生物学、分子或细胞水平的疾病和功能列表，这些疾病和功能最能代表膀胱癌中表现出的改变分子。基于p值和膀胱癌中改变的分子数量选择的 IPA 评分；更具体地说，p值是根据给定途径中改变的分子数除以来自特定途径或生物过程的分子总数来计算的

图 6

NGS 发现的基因及其 miRNA 靶标的膀胱癌特异性 miRNA 基因调控网络。a与膀胱癌相关的大多数相关 miRNA 分子网络的重叠。过表达的 miRNA 以红色突出显示，下调的 miRNA 以绿色标记，从文献中确定的最相关的靶基因以灰色显示。实线表示直接动作，虚线表示间接动作。b IPA 分析用于鉴定与上皮间充质转化 (EMT) 相关的 miRNA ( c ) IPA 分析用于鉴定与炎症相关的 miRNA

miRNA 靶向膀胱癌相关基因

为了确定 miRNA 表达改变对膀胱癌的生物学意义，使用 miRTarBase 来确定经过验证的靶基因。与上调最多的 miRNA 相关的靶基因被分为特定的家族。这些 miRNA 家族在翻译过程的调节中具有重要作用，并且通过它们的识别，可以关联癌症的相关标志。使用 miRnet 数据库，我们确定了初始 miRNA-目标相互作用，并在附加文件7中表示了网络：图 S2。在初步调查之后，我们查看了 miRNA 靶标之间的每个单独交互，这些可以在附加文件7中看到：图 S2。

在附加文件8：图 S3A 中，呈现了参与 PI3K-AKT 信号通路和紧密连接的 miR-23a-3p 的靶基因，并分别以红色和蓝色强调。附加文件7：图 S2B 显示了参与趋化因子信号通路的 miR-139-5p 的靶基因，颜色为蓝色，而目标基因涉及粘着斑，颜色为红色。附加文件8：图 S3C 以蓝色显示调节细胞周期的 miR-141-3p 的靶基因，以红色显示癌症中最常突变的 miRNA 调节基因。附加文件8：图 S3D 以蓝色显示参与粘着斑的 miR-143-5p 的靶基因，以红色显示癌症中最常突变的 miRNA 调节基因。附加文件8：图 S3E 显示了 miR-205-5p 的靶基因，黄色为粘附连接，绿色为粘着斑，蓝色为最常修饰的癌症通路，红色为癌症中最常突变的 miRNA 调节基因。完整的附加文件8：图 S3 强调了 EMT 和 miRNA 在频繁突变的基因或失调通路方面的重要关系；与选定的 miRNA，控制细胞粘附的某些方面。多个核心调节过程或信号通路已证明与膀胱癌肿瘤进展具有功能相关性，特别是在侵袭性和复发方面。这对膀胱癌的诊断和/或预后有重要影响。

改变的 miRNA 和频繁突变基因的网络分析

突变基因与评估的改变的 miRNA 之间的相互联系见图 1。 7. 正如预期的那样，miRNA 不是孤立的转录物。大量 miRNA 就是例证，它们在膀胱癌中具有改变的表达水平，与最常见的突变基因（TP53、FGFR3、KDR、PIK3CA和ATM）相关。数字 7还强调了影响转录组模式的直接或间接模式，其中包括其他 miRNA。一些基因的改变，包括TP53、FGFR3、ATM、KDR和PIK3CA，已被证明会引发癌变，并与膀胱癌中大量改变的 miRNA 转录本交织在一起（附加文件8：图 S3）。

图 7

膀胱癌中下调（miR-139-5p 和 miR-143-5p）和过表达（miR-23a-3p、miR-141-3p 和 miR-205-5p）的 MicroRNA 靶向参与膀胱癌致癌网络的多个基因如 KEEG 所示。红色矩形代表上调的 miRNA，而深绿色矩形代表下调的 miRNA。此图是根据 KEEG 数据库的输出开发的

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讨论

膀胱癌是一种异质性很强的疾病，这使得匹配/配对的样本有利于分析其分子谱。这允许对有限数量的患者进行 miRNA 分析评估；然而，正是与 TCGA 数据的重叠特别允许识别最具代表性的改变的转录本。理解任何疾病的重要性不在于某些转录组信息（如 miRNA）的具体量化。而是这种转录组学信息如何与特定的遗传改变及其内在的细胞机制相关，这会影响其中的平衡，从而促进疾病的进展或朝向疾病的进展。

确定了膀胱癌中的特定 miRNA 模式，从中选择的单个 miRNA 子集及其组合与总体存活率相关。这项研究代表了开发 miRNA 表达特征作为 BC 诊断工具的基础，也鼓励我们理解 miRNA 在疾病起始或进展中的功能。此处报告的膀胱癌综合 miRNA 分析扩展了我们的知识，基于建立对预后或诊断具有临床重要性的综合特征性 miRNA 特征。

我们的数据表明膀胱癌中 miRNA 的持续失调。一些改变的 miRNA 在所有癌症类型中都有表现，例如 let-7 家族成员 [ 14-18 ]。此外，miR-21 是人类癌症中常见的上调 miRNA，这在我们的案例中似乎也是一致的。在膀胱癌体外模型中，miR-21 能够通过与 PTEN 和 TP53 的串扰调节细胞增殖和迁移 [ 19 ]，这是与膀胱癌发生相关的最重要通路之一 [ 20 ]。最近的一项研究证实，在分析通过将组织与血浆样本配对生成的数据时，膀胱癌中 miR-21、miR-205 和 miR-200c 的表达水平发生了变化 [21 ]]. 正如之前的作者总结的那样，我们确实发现 miR-205 对膀胱肿瘤组织具有特异性，此外，这种 miRNA 一直被上调。

此外，我们能够识别上皮细胞向间充质状态 (EMT) 转变的特定 miRNA 特征。EMT 是与肿瘤侵袭、耐药性和干细胞样潜能相关的众所周知的过程 [ 22 ]。这些与 EMT 相关的转录本特别调节粘附力的丧失，导致细胞运动性增加，从而促进转移。已证明基因BCL2、CDH11、ZEB1/ZEB2和TIMP2分别被 miR-200b/c、miR-200c 和 miR-200c 靶向，从而对 EMT 的粘附和间接调节产生这种调节作用 [ 23 – 26 ]，也强调在图的图33个d.

miR-200 家族（尤其是 miR-200c 和 miR-141）的表达与 E-钙粘蛋白的表达之间似乎存在反比关系，同时表现出 ZEB1 表达的显着下调 [27 ]。这提供了一个重要的治疗靶点，值得进一步明确地研究膀胱癌，以加强细胞之间的粘附并阻碍 EMT。miR-200 家族（miR-141/200c 和 miR-200a/200b/429）表达水平的详细评估表明在 BC 中经常上调，但在其他癌症类型中经常下调，如肾癌 [28 ]。MiR-200c 表达水平与早期 T1 膀胱肿瘤进展相关 [ 29]. 更具体地说，miR-200c 下调与肌肉浸润性膀胱癌的进展和不良预后有关 [ 29 ]。在涉及 EMT 和侵袭的膀胱癌中具有改变表达水平的其他 miRNA 是 miR-141。在多种其他病理学 [ 30 ] 中，不仅膀胱癌 [ 31 ]，miR-200c 和 miR-141 也被认为是预后标志物 [ 32 ]。应该注意的是，对于所研究的膀胱癌样本范围，miR-205 和 miR-200c 的表达水平存在很大争议 [ 22、33、34 ] ，通常被报道为下调 [ 35 ]和过度表达 [ 17 ]。

在最近的一篇评论文章中，miR-145 被描述为膀胱癌中经常下调的miRNA [ 27、36、37 ]，我们的数据证实了这一点。miR-143/145 在文献中被描述为在多种癌症（包括膀胱癌）中具有肿瘤抑制功能的簇[ 28、38 ]。我们发现 miR-143 在膀胱肿瘤组织中表达下调，并且它与 RAS、ERK、P53、Rb 或 E2F 相互作用（图 8）。一些作者认为，下调的 miR-143 受癌蛋白 EZH2 的调节， EZH2经常在膀胱癌中过度表达，代表一个重要的治疗靶点，而不仅仅是一个生物标志物 [39、40 ]。

一些研究表明miR-133b 在膀胱癌中下调，但在其他癌症中也是如此 [ 36、41 ]。它不仅针对细胞凋亡和细胞增殖机制 [ 42 ] ，还针对通过 EGFR（表皮生长因子受体）及其下游或上游效应子的迁移和侵袭 [ 43、44 ]。我们下调的另一个转录本是 miR-139，其表达水平、与 MMP 的相互作用（图 8）和粘着斑的相关基因网络（附加文件 7 ：图S2B）与文献数据一致 [ 45、46 ]。

对于膀胱癌，许多改变的 miRNA 被证明可以在多个水平上调节 TP53 网络 [ 28、50 ]，强调了TP53状态的重要性。TP53 过表达（通过 IHC）被证明与该基因中导致其失活的突变的存在有关。反过来，TP53 的失活会促进癌细胞的肿瘤发生，而且并非巧合，它与人类肿瘤的低存活率相关。Puzio-Kuter 等人进行的一项研究。(2009) 表明，膀胱上皮细胞中 TP53 和 p10 的联合失活导致小鼠模型中的浸润性癌症特征 [ 51]. 作者声称删除 p53 和 p10 的协同作用是由 mTOR 信号的放松管制介导的。具体而言，观察到 TP53 与 miR-200a、miR-214、miR-513 和 miR-1225 相互作用。此外，miR-19 提供了 TP53、KDR、ERBB4 和 PIK3CA 之间的可能联系。低级别癌通常有PIK3CA突变，在 CDKN2A 失活后进展为高级别肿瘤 [ 52 ]。PIK3CA水平上特定 SNP 的存在与膀胱癌风险相关。因此，识别和靶向 PI3K/AKT/mTOR 通路的遗传变异对膀胱癌的预后具有重要的临床意义 [ 53 ]。

在我们的调查中观察到受体酪氨酸激酶通路的 TP53 突变改变，这与文献日期一致。该通路在大约 40% 的膀胱癌病例中被激活（FGFR3： > 10%，EGFR： > 10%，ERBB2： ~ 10%，ERBB3： ~ 10%，NRAS/HRAS/KRAS： ~ 10%，PTEN：~ 10 %, AKT3 :~ 10%) [ 54 ]。TCGA 数据揭示了 58 个显着突变的基因和几种遗传途径的高发生率 [ 52 ]。在我们的研究中，证实了TP53突变体和野生型的总体存活率之间的重要差异；先前关于膀胱癌的研究证实了这一事实 [55 – 57 ]。文献数据报告了 FGFR 表达水平的频繁改变 [ 7 , 58 ]，如果进一步阐明，这在对治疗的反应中具有重要作用 [ 59 , 58 ]。在我们的案例中，13/24(54%) 中的单个外显子突变（外显子：NM_000142.4）被识别并使用 FATHMM 网络服务器确定为致病性。FGFR3和TP53已被证明在我们分析的样本中具有更高的突变发生率。我们使用 miRnet 数据库进行了演示（参见附加文件8：图 S3。）这些基因确实与我们调查中改变的几个 miRNA 相互作用，但是，相互作用的细节尚未被发现。基于我们的结果并使用 KEGG 数据库，在图 8 中，我们提出了与 BC 致癌相关的基因与我们改变的 miRNA 表达之间的相互作用（▼ miR-139-5p; ▼ miR-143-5p; ▲ miR-23a-3p ; ▲ miR-141-3p; ▲ miR-205-5p)。最后，重要的是要强调转录组的复杂性及其与基因组的相互作用，特别是如果将突变状态添加为另一个分析级别。

最后，ERBB4（表皮生长因子受体 4）属于生长因子受体酪氨酸激酶 (TKI) 的 ERB 家族，通过两个主要途径 Ras/Raf 参与调节细胞增殖、细胞分化、迁移和侵袭的相关机制/MAPK 和 PI3K/Akt/mTOR 信号 [ 60 ]。在我们分析的 23 个配对样本中的 11 个中发现了这种类型的突变，并且在预测对 TKI 抑制剂的反应方面具有重要的临床应用。ERBB4 突变基因已被证明与上述 miR-145 和 miR-193a 相互关联，但我们只发现了一个内含子突变，没有致病作用。

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结论

miRNA 表达水平的改变影响肿瘤分子表型。这些变化可以通过它们展示 BC 的途径间接检测到；例如，在这些途径中发现的关键基因中存在某些特定突变。miRNA 作用于基因，改变它们的表达会影响影响癌症发展和预后的各种功能。可以在 EMT 相关 miRNA（miR-141b、miR-200 s 或 miR-205）中找到更具体的例子，它们在分子机制中发挥重要作用，是与肿瘤发生、侵袭和转移相关的潜在关键过程。

为了进一步扩展相互作用的复杂性，miRNA 可以同时靶向同一信号通路或多个信号通路的多个组件。通过将相关突变与改变的 miRNA 表达相结合，可以更好地了解这个复杂的网络，这有助于加深对膀胱癌肿瘤发生、进展和复发的理解。对分子数据的综合理解有助于在细胞水平上识别重要目标，这将导致新的临床和生物学策略来管理 BC 中的个性化治疗 [61 ]]. 尽管此 NGS 研究中的病例数量有限，但我们能够证明干扰不同信号通路的基因畸变，尤其是那些与 EMT 调节相关的通路。此外，我们能够从改变的 miRNA 转录本的代表性列表中证明频繁突变的基因 TP53、FGFR3、PIK3CA 或 ATM 之间的串扰（如图 1 所示）。的图66个和图 S4)，作为治疗干预点或潜在的生物标志物。

Braicu C, Buiga R, Cojocneanu R, Buse M, Raduly L, Pop LA, Chira S, Budisan L, Jurj A, Ciocan C, Magdo L, Irimie A, Dobrota F, Petrut B, Berindan-Neagoe I. Connecting the dots between different networks: miRNAs associated with bladder cancer risk and progression. J Exp Clin Cancer Res. 2019 Oct 29;38(1):433. doi: 10.1186/s13046-019-1406-6. PMID: 31665050; PMCID: PMC6819535.