今天推送的文章发表在Angew.Chem.Int.Ed.的“SubstantialImprovementofanEpimerasefortheSynthesisofD-AllulosebyBiosensor-BasedHigh-ThroughputMicrodropletScreening”，通讯作者为天津科技大学生物技术学院工业微生物重点实验室的秦慧民教授。D-ALLULOSE（D-阿洛

今天推送的文章发表在Angew.Chem.Int.Ed.的“Substantial Improvement of an Epimerase for the Synthesis of D-Allulose by Biosensor-Based High-Throughput Microdroplet Screening”，通讯作者为天津科技大学生物技术学院工业微生物重点实验室的秦慧民教授。

D-ALLULOSE（D-阿洛酮糖）是一种低热量罕见的酮己糖，血糖指数和热量含量低，是食品制造中公认的安全糖替代品。D-ALLULOSE还具有多种有益的生理功能，如抗高血糖、神经保护和抗动脉粥样硬化作用、降低血脂水平和活性氧清除活性，D-ALLULOSE生物合成已成为制药、营养食品和食品制造业的研究热点。酮糖3-差向异构酶（KEase）负责将D-果糖异构化为D-麦芽糖，是生产D-氨基葡萄糖的首选生物催化剂候选。由于结构-活性关系背后的分子机制不清楚，缺乏足够灵敏和快速的筛选工具，关于工程化KEases提高催化活性的研究有限。

在本研究中，作者设计了一种实时监测D-ALLULOSE的生物传感器。为了提高生物传感器的灵敏度，进行了调节工程，并通过将KEase表达系统与该改良的生物传感器系统集成，构建了D-ALLULOSE检测酶筛选系统（DA-DESS）。此外，基于该DA-DESS构建了一个基于超高通量液滴的微流体筛选平台（DMSP），用于D-ALLULOSE3-差向异构体（DAEase）工程。基于结构引导的合理设计和定向进化，使用DMSP获得了催化活性改进的的突变体。最后通过晶体结构研究和分子动力学（MD）模拟阐明了增强催化活性的分子基础，确定了底物识别机制。

构建D-Allulose-检测酶筛选系统

为了实现对DAEase文库的超高通量筛选，作者设计了一种D-allulose检测生物传感器系统（DA-DBS），动态监测D-allulose水平。在不存在D-allulose的情况下，该转录调节器PsiR将与启动子pPsiA结合，抑制绿色荧光蛋白表达；当D-allulose被引入DA-DBS系统时，PsiR将优先结合D-allulose，解除对绿色荧光蛋白表达的抑制（图 1a）。该传感器系统的荧光强度与D-Allulose浓度之间存在紧密的正相关，且该生物传感器对D-alllose具有很强的特异性（图 1b）。作者进一步重新设计了转录调节器PsiR，以增强生物传感器系统对D-Allulose的敏感性。一种突变体PsiR(PsiRG133D/Y233R)在低浓度D-Allulose时表现出比WT增强的荧光强度（图 1c），表现出显著更高的反应敏感性。对PsiR的结构建模分析表明，残基Gly133和Tyr233位于配体结合袋中。G133D和Y233R的带电残基取代在转录因子和D-Allulose之间引入了新的氢键相互作用，这可能会加强D-alllos在配体结合口袋中的位置，从而提高PsiR对D-Alluloses的反应敏感性（图 1d）。

接下来，作者将SfDAE（具有优异热稳定性和中间活性的D-alllose 3-差向异构酶）整合到DA-DBSPsiR-G133D/Y233R系统中，获得D-Allulose-检测酶筛选系统（DA-DESS；图 2a），荧光强度与D-果糖浓度之间紧密正相关。为了避免菌株间的信号干扰，作者设计了微流体筛选平台（DMSP）以最小化D-Allulose扩散，其中每个细胞被分隔、封装并在液滴中分类（图 2d）。该平台由四个主要步骤组成：1） DAEase突变体库的构建（图 2c）；2） 单细胞和D-果糖由液滴制造装置共同封装；3） 将细胞在液滴中孵育以进行增殖和DAEase全细胞催化；4） 使用分选装置根据其荧光信号分选液滴。最后回收正突变体并进行活性测定（图 2d）。然后作者使用该DMSP平台选择野生型SfDAE（SfDAE_WT）和两种突变体H9S和P245T进行，确定了DMSP平台的筛选可靠性和分选效率（图 3）。

酶活性的结构机制

为了深入了解酶活性的结构机制，作者获得了SfDAE的X射线晶体结构和具有不同配体（D-岩藻糖、D-麦芽糖、D-塔格糖和D-山梨糖）的复合物。D-Allulose通过与His9、Glu146、Glu152、His182、His205、Arg211和Glu240形成氢键与酶稳定结合。SfDAE配体复合物的结构分析还首次揭示了KEase家族中底物诱导的变构调控。特别是，α11螺旋及相关环（残基I243–L253）位于活性位点的入口处，形成一个柔性盖域。SfDAE的无底物结构揭示了α11螺旋的开放至闭合构象开关，当底物结合时，其经历了大的构象变化（旋转约55°）以暴露活性位点，并为底物进入提供了开放状态（图 4a、b），柔性α11螺旋对底物结合和催化活性至关重要。对KEase家族酶结构的比较表明盖子-α11螺旋/环的构象变化和结构调节了底物识别。

为了阐明当底物进入SfDAE通道至催化中心时，作者使用MD模拟探索了底物识别过程中构象从开放转变为封闭的变构调节机制，结果发现α11螺旋和环区F242–K261比环G107–G114和V148–N157具有更高的迁移率和更大的可接近构象空间。α11螺旋发生了非常显著的构象变化，这表明当底物进入活性位点时，该区域实际上具有类似开关的调节作用（图 4c）。随后利于主成分分析（PCA）用于确定关键的盖环构象运动（图 4d），还使用马尔可夫状态模型（MSM）评估盖环如何灵活地影响底物结合。对所有MSM衍生的宏观状态的检查表明，D-果糖需要显著的α11螺旋骨架运动才能进入埋藏腔（图 4e）。这些转变由控制结合口袋可及性的构象开关控制，从而影响底物识别。

合理设计与定向进化提高SfDAE催化活性

作者利用基于结构的合理设计来重塑SfDAE的活性口袋和α11螺旋，以提高催化活性。在底物结合袋和α11螺旋区中总共选择了20个候选残基作为诱变目标（图 5a）。应用CAST/ISM策略构建了一个突变体库1，并使用DMSP筛选突变体，在液滴内的荧光测定中监测D-Allulose的形成( 5b)。结构分析表明，His9和Ser11与D-果糖直接或间接相互作用，Met15在开放-闭合构象转换中经历了可观察到的构象运动。因此，对这三个残基进行第一轮突变以增强酶活性。在筛选第一轮残基后，只有一个S11（M1-1）活性增强（图 5b）。在接下来的几轮中，分别鉴定了突变L42T（M1-2，比WT高2.87倍）。突变I109E（M1-3，3.42倍提高）、E152N（M1-4，4.92倍提高）和P247G（M1-5，5.85倍提高）。

SfDAE结构分析表明，残基Pro246、Val249和Leu253有助于疏水口袋，以容纳封闭状态下的底物，对底物识别和催化活性至关重要。动力学参数表明突变体M1-3的Km值明显降低，有助于高催化效率。突变体M1-5的催化效率非常高，与WT SfDAE相比，催化效率提高了10.61倍（图 5c、d和表 1)。

接下来，作者使用易错PCR方法生成随机突变SfDAE M1-5文库（突变体库 2），并利于DMSP筛选活性进一步增加的突变体。结果鉴定了突变体M3-2，其活性提高了8.23倍。动力学参数分析表明，突变体M3-2具有最高的催化活性，比野生型SfDAE高17倍（表 1和图 5c和d）。且WT SfDAE和M3-2突变体表现出类似的热稳定性。这些结果表明，与Dorea sp.DAEase（先前报道的最高活性）相比，M3-2突变体表现出相似的比活性，但热稳定性更高。在SfDAE催化的D-果糖异构化为D-麦芽糖的过程中，突变体M1-5和M3-2仅分别用2.0和1.5 h达到了30%的转化率，转化率和产率为远远高于WT （图 5e）。这意味着通过结构引导的合理设计和使用DMSP的定向进化，成功创建了一种高活性的SfDAE变体。

结构分析解析M3-2改进的催化效率

为了深入了解最佳突变体M3-2中D-果糖的异构化，作者比较了WT SfDAE和M3-2的结构信息。结果表明在底物结合袋周围分别用Glu和Tyr取代Ile109和Phe242的残基产生了与D-果糖的O1和O5的新氢键，有利地将底物定位在活性位点袋中（图 5f）。这一发现表明，M3-2对D-果糖的提高的催化效率至少部分来自于通过增加氢键相互作用提高的蛋白质与D-果糖的结合亲和力。Gly取代Ser11可能会扩大活性位点袋的底物容纳能力（图 5f）。突变体M3-2的α11螺旋盖结构域的移动导致残基Glu248和Gly252分别接近Thr42和Asn152，同时形成一些特定的非共价相互作用，似乎稳定了底物催化的闭合构象。因此，突变体M3-2中的突变不仅提高了底物结合亲和力，而且适度扩大了底物结合口袋，表现出比WT SfDAE改进的催化活性。MD模拟表明，在WT和M3-2的结构中，α11螺旋（残基I243–L253）的RMSF具有显著差异。M3-2的RMSF值相对较高，其盖区比WT SfDAE中的盖更灵活，显示出比WT SfDAE更高的迁移率和更大的可接近构象空间。这种增强的柔性可以帮助底物进入并结合在结合口袋中，从而导致M3-2的更高催化活性。M3-2盖区的P247G突变可能为延伸的构象提供所需的构象灵活性，以便于底物进入（图 5f）。

顶级复刻，货到付款，质量保证，对版发货，售后五年，添加 微信：AFZF66  备注：大云时间圈！

●25岁青春洋溢，35岁成熟稳重，处在25~35岁这个年龄段的男人，魅力各有不同，却有着同样的风华正茂。适合这个年龄段佩戴的腕表呢，可以说是数不胜数，但是也正因如此，才会导致各位出…

卡西欧和雷诺手表都是知名的手表品牌，都有其独特的特点和历史。在选择手表时，很多消费者会对卡西欧和雷诺手表进行比较。究竟是卡西欧手表更高档还是雷诺手表更高档？让我们通过以下几个方面来…

前三篇文章分别介绍了西铁城电波手表30周年纪念版「DENPA Limited Models YOAKE COLLECTION」第一款不锈钢光动能电波手表CB5876-60E(下图右…

西腾手表属于什么档次？ 西腾手表是近年来备受瞩目的高端手表品牌之一。作为一款奢华的手表，西腾手表以其精湛的工艺和卓越的品质在钟表界享有盛誉。那么，西腾手表到底属于什么档次呢？本文将…

香奈儿手表女款：经典与时尚的完美结合 香奈儿（Chanel）作为世界顶级奢侈品牌之一，以其独特的设计和高品质的制作工艺而闻名于世。除了时装、香水和皮具，香奈儿手表也备受追捧。香奈儿…

近日，香港艺人梁景辉（艺名梁烈薇）在社交平台晒出了自己的名表，据懂表的人士透露，这块表的价值高达70万。 有网友问梁景辉这只表多少钱，梁景辉说：这块表的价值已经远远超过了它的售价。…

两年前，天梭 (Tissot) 发布了 PRX，作为其标志性的 1978 PRX 40 205 的复刻版，配备石英机芯，后来又增加了自动计时和日期型号。去年，天梭发布了 PRX 自…

送手表的含义是什么？ 每个礼物都有其特殊的含义和象征意义，而送手表更是其中一种既实用又具有深远内涵的礼物。无论是情侣间的交换手表，还是作为生日、毕业或职业晋升的礼物，手表总能传达出…

如果克里斯蒂亚诺·罗纳尔多（Cristiano Ronaldo）许多收藏家羡慕最新的手表，我们不会感到惊讶。 这位足球传奇人物和雅各布公司（Jacob&Co.）合作的最新…

这个表不是你的姐姐？ 不是我的！专柜原价差不多50万左右，这是我打工老板几个月没开工资，他给我抵的。他说是个金表，我不敢相信你看看。 这个表不是你的姐姐？ 不是，听你口音不是本地的…