文献题目：Single-cell transcriptomic analysis suggests two molecularly subtypes of intrahepatic cholangiocarcinoma

中文题目：单细胞转录组分析提示肝内胆管癌有两种分子亚型

杂志及影响因子

研究意义: 肝内胆管癌（iCCA）是仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝恶性肿瘤，异质性高、预后较差，并且近年来全球发病率不断上升。

前期的研究发现 iCCA 存在两种主要亚型，即起源于靠近肝门部胆管上皮细胞的大胆管型和起源于外周胆管上皮细胞的小胆管型。它们在肿瘤细胞形状和患者预后方面存在显著差异，但目前还没有明确的生物标志物对其进行区分，因此也限制了人们对两者生物学、分子特征和治疗反应差异的认识。

本研究使用单细胞转录组测序技术（scRNA-seq） 对源自 iCCA 患者的 14 对肿瘤组织和非肿瘤肝组织中的近 15 万个细胞进行捕获和解析，并鉴定出 S100P 和 SPP1 是 iCCAphl和 iCCApps的生物标志物，并揭示了两亚型在临床病理特征、基因调控网络和免疫浸润方面存在显著差异。

总之，该研究对揭示 iCCA 中肿瘤细胞的多样性具有重要意义，并为将来疾病分层、分子靶向治疗等奠定了理论基础。

导读

肝内胆管癌 (iCCA) 是仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝恶性肿瘤，可起源于位于二级胆管以上胆道的任何位置的胆管细胞，异质性高、预后较差，并且近年来全球发病率不断上升。

最近，世界卫生组织和欧洲胆管癌研究联盟根据主要的组织学特征将 iCCA 分为两种不同的亚型，包括肝门周围大导管型 (iCCAphl) 和外周小管类型 (iCCApps)。最新的证据也表明，iCCA 的两种组织学亚型具有不同的细胞来源和发病机制。

虽然说这两种 iCCA 亚型在肿瘤细胞形状和患者预后方面存在显著差异，但目前还没有明确的生物标志物对其进行区分，因此也限制了人们对两者生物学、分子特征和治疗反应差异的认识。

近日，来自复旦大学、北京大学、中国科学院上海巴斯德研究所等单位的研究人员在Nature Communications发表了题为Single-cell transcriptomic analysis suggests two molecularly subtypes of intrahepatic cholangiocarcinoma的文章，在这项研究中，他们使用单细胞转录组测序技术 （scRNA-seq） 对源自 iCCA 患者的 14 对肿瘤组织和非肿瘤肝组织中的近 15 万细胞进行捕获和解析，并鉴定出 S100P 和 SPP1 是 iCCAphl 和 iCCApps的生物标志物；与 S100P-SPP1+iCCApps相比，S100P+SPP1−iCCAphl表现出显著降低的 CD4+T 细胞和 CD56+NK 细胞的浸润，而CCL18+巨噬细胞和 PD1+CD8+T 细胞的数量却在增加，侵袭性较强且预后较差。

总之，该研究对揭示 iCCA 中肿瘤细胞的多样性具有重要意义，并为将来疾病分层、分子靶向治疗等奠定了理论基础。

图片来源：Nature Communications

主要研究内容

单细胞水平解析 iCCA 的肿瘤生态系统

该团队对来自 14 例初诊 iCCA 患者的肿瘤和配对的邻近非肿瘤肝组织进行了 scRNA-seq 和全外显子组测序 (WES)。

经过严格的质量控制，他们共获得了144878个细胞的单细胞转录组信息。

经过数据降维、聚类及亚群定义等，共鉴定了 13 个主要细胞群，包括上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞 (DC)、自然杀伤细胞 (NK)、CD4+T 细胞，调节性 T 细胞，CD8+T 细胞，B 细胞，成纤维细胞和内皮细胞等。

通过对 KRT19 高表达上皮细胞的拷贝数变异 (CNVs) 分析，共预测出23667个恶性肿瘤细胞。

进一步的分析发现，恶性肿瘤细胞表现出强烈的肿瘤间异质性，并形成患者特异性的细胞亚群。此外，免疫浸润细胞在不同患者之间、肿瘤组织与肿瘤周围组织之间存在明显的异质性。

图片来源：Nature Communications

SPP1 是 iCCApps的有效生物标志物

为了在单细胞水平上探索不同细胞来源的 iCCA 亚型，他们首先检测了先前提出的 iCCAphl标记物，如 S100P、MUC5AC 和 MUC6 以及 iCCApps 的标志物 NCAM1 和 CDH2 在恶性细胞中的表达。

结果发现，S100P 的确能够标记 90% 以上的 iCCAphl恶性细胞，然而前期发现的 iCCApps生物标记物的鉴别效果却很差。

为了寻找更具有代表性的 iCCApps标记物，研究人员寻找了与 S100P 相互排斥但在 iCCApps中广泛表达的基因。

结果发现，SPP1 等基因在 S100P 阳性细胞中低表达，而在 S100P 阴性细胞中却高表达，使其成为潜在的生物标志物。随后也通过实验证实了S100P 阴性 iCCAs 患者在细胞和组织水平上均高表达 SPP1。

因此，他们根据 S100P 和 SPP1 的表达情况，将 iCCAs 患者分为 S100P+SPP1−iCCAs 和 S100P-SPP1+iCCAs 两类。生存分析结果显示，S100P+SPP1−iCCAs 的预后明显比 S100P-SPP1+iCCAs 更差，多因素回归分析也进一步证实了这一点。

图片来源：Nature Communications

S100P+SPP1−和 S100P-SPP1+iCCAs 癌症细胞的分子特征和转录网络

上述的研究结果发现，iCCAs 中存在两个主要的恶性细胞亚群。随后，他们继续探索了这两类恶性细胞独特的基因表达谱。

他们在基因组和单细胞转录组两个维度上评估了它们的肿瘤内异质性，结果显示基因组层面无显著差异，但转录组层面则显示 S100P+SPP1−肿瘤内异质性显著较高。这也与之前的一项研究一致，即较高的肿瘤内异质性代表着较差的生存率。

图片来源：Nature Communications

他们进一步应用 SCENIC 来分析 S100P+SPP1− 和 S100P-SPP1+细胞之间的转录调控网络。

结果表明，ATF3、REB5、MEIS2 和 EGR1 等转录因子在 S100P-SPP1+细胞中表达上调；而在 S100P+SPP1−细胞中，CREB3L1、PPARG、CDX2 和 HOXB7 等转录因子显著富集。

更加有意思的是，SCENIC 分析显示 CREB3L1 是一种潜在的调控 S100P 的转录因子。同时，CREB3L1 表达与 S100P 表达也呈现显著正相关。

为了确定 S100P 是否为 CREB3L1 的直接靶点，他们进行了双荧光素酶报告实验，发现过表达 CREB3L1 后，S100P 启动子活性以剂量依赖的方式显著增加。迁移实验的分析表明也表明 CREB3L1 的敲除显著削弱了肿瘤细胞的侵袭能力。

总之，这些结果揭示了S100P+SPP1− 和 S100P-SPP1+细胞不同的转录谱，并且鉴定出CREB3L1 可作为 S100P 的潜在调控转录因子，进而促进 iCCAs 恶性细胞的侵袭。

图片来源：Nature Communications

iCCApps含有不同分化状态的肿瘤细胞

ALB 的表达通常被认为是肝细胞的标志，已有多项研究证实 ALB 在 iCCAs 中表达，但这些 ALB 阳性肿瘤细胞的分子特征尚不清楚。

通过比较 ALB+和 ALB-细胞的基因表达谱，他们发现 ALB 阴性细胞高表达 ID3，ID3 负调控碱性螺旋-环-螺旋，参与细胞分化和肿瘤转化；而 ALB 阳性细胞则高表达肝细胞特异性基因以及胆管细胞标志物，但不表达甲胎蛋白和肝脏祖细胞的标记基因。

图片来源：Nature Communications

先前的研究已经将 ID3 阳性细胞指定为肝母细胞，它可以同时生成肝细胞和胆管细胞。为了揭示 iCCAs 的分化过程，他们通过发育轨迹分析来探索基因在这一转变过程中的表达模式。

结果发现，ALB+细胞主要位于该轨迹的末端，参与凝血调节、内质网管腔调节、内质网应激反应的基因沿该发育轨迹逐渐增加。同时，MKI67 的表达与 ALB 的表达趋势一致，提示 ALB+细胞增殖能力较强；而 ID3+细胞的发育轨迹则与 ALB+细胞相反，其在含有细胞外基质的胶原中富集，并负调控细胞粘附。

图片来源：Nature Communications

ID3+肿瘤细胞提示 iCCApps预后较差

接下来，他们探讨了 ID3+iCCApps的临床和组织学特征。通过免疫染色，他们发现 ID3 主要表达在位于肿瘤中心的肿瘤细胞的细胞核中，并被丰富的间质成分包围。

为了进一步探讨 ID3 表达与肿瘤间质的关系，他们在两个公共数据库中分析 ID3 表达与肿瘤相关成纤维细胞 (CAFs) 的相关性。结果表明，ID3 的表达与代表 CAFs 的 PDGFRB、COL1A1、PDPN 呈明显的正相关。

图片来源：Nature Communications

由于 CAFs 在肿瘤进展和化疗耐药性中发挥重要作用，因此他们推测 ID3 的表达与 iCCA 的预后有关。生存分析曲线表明，在 iCCApps中，CK19+ID3+肿瘤细胞比例和 CK19-PDGFR β+ 细胞比例均与不良预后显著相关。

因此，这些结果表明，ID3 阳性细胞通常与 iCCApps中 CAFs 的存在和患者的不良预后相关。

图片来源：Nature Communications

结语

综上所述，在本研究中，他们构建了 iCCAs 的单细胞转录组图谱，并鉴定了 SPP1 作为 iCCApps的代表性标记基因。

他们发现 92.5% 的 iCCAs 患者可以根据 S100P 和 SPP1 的表达分为 iCCAphl和 iCCApps，两种 iCCA 亚型在临床病理特征、基因调控网络和免疫浸润方面存在显著差异，这也为了解不同细胞来源的 iCCAs 提供了线索。

图片来源：Nature Communications

本文仅供医疗卫生等专业人士参考

策划：GoEun，梅浙

题图来源：站酷海洛PLUS

参考文献

1， Song, G., Shi, Y., Meng, L. et al. Single-cell transcriptomic analysis suggests two molecularly subtypes of intrahepatic cholangiocarcinoma. Nat Commun 13, 1642 (2022).

2. Banales, J. M. et al. Cholangiocarcinoma 2020: the next horizon in mechanisms and management. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 17, 557–588 (2020).

3. Zhang, M. et al. Single-cell transcriptomic architecture and intercellular crosstalk of human intrahepatic cholangiocarcinoma. J. Hepatol. 73, 1118–1130 (2020).