SNP分型（或基因突变检测）的费用与需要分型的SNP位点，数目以及样品数量差异甚大，分型的质量与采用的方法各有区别。楚天生物采用多种SNP分型方法， 包括美国Agena MassArray， 等位基因专一性PCR（AS-PCR），限制性内切酶片段多样性（PCR-RFLP）， 高分辨率熔解曲线分析（HRMA， high resolution melting curve analysis），荧光探针法。我们会根据您的SNP位点及其上下游序列特征，需要分型的SNP数目以及样品数目确定最佳方案，提供最优性价比服务。

楚天生物SNP研究流程

1. Agena MassARRAY 原理简介

美国Agena公司MassARRAY SNP基因分型技术是基于飞行质谱的分型技术。首先通过PCR将跨越SNP位点的DNA序列扩增出来，然后应用单一延伸引物(extension primer)扩增PCR产物。设计延伸引物时，要求引物的3‘末端距离SNP位点只有一个碱基。进行延伸反应时使用双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，以确保延伸引物只延长一个碱基。延伸产物用飞行质谱(TOF, time of flight)进行分析。虽然一个碱基的分子量差别很小，但应用特别设计的飞行质谱足以根据这微小差别进行分型。 MassARRAY的优势是可以进行多重SNP分型，即一个反应可同时分型多个SNP位点。该技术在分析数百上千个样品的数十上百个SNP时具有价格优势。缺点是仪器昂贵。

等位基因专一性PCR的原理是根据SNP位点设计某一等位基因专一性引物，使得PCR只扩增某一个等位基因。举例说明，等位基因1和等位基因2 在SNP位点分别为C和T，设计引物时，扩增等位基因1和2的引物分别按照C或T设计，另一引物相同。在最理想情况下，扩增等位基因1的引物不能扩增等位基因2，反之亦然。但实际上由于基因专一性引物只在SNP位点相差一个碱基，二者都可能存在非特异性交叉扩增，即设计扩增等位基因1的引物可以扩增等位基因2，反之亦然。但多数情况下错配扩增的效率比完全互补扩增的效率低。通过在SNP位点外引人额外的错配或优化PCR反应体系，可以进一步增大两者扩增效率的差别。传统的等位基因专一性PCR通过凝胶电泳来分析PCR产物，进而确定基因型。这种方法虽然经济，但出错率高。应用实时荧光PCR进行等位基因专一性PCR，分型准确。

HRM技术，即高分辨率熔解曲线分析技术 (high resolution melting curve analysis)，是应用高分辨率的荧光染料在饱和浓度下对PCR产物进行熔解曲线分析，通过Tm值和熔解曲线的特征形状，确定SNP基因型，或基因突变。下图示意A－>C突变的HRM分析结果。杂合子A/C的熔解曲线可以清晰地与纯合子A/A 和C/C分开(左图)。纯合子A/A 和C/C熔解曲线区别很小，通过图形处理，二者的区别也显而易见(右图)。熔解曲线分析技术诞生已久，但传统的熔解曲线分析技术因为分辨率低，没有用于基因突变检测和SNP分型。高分辨率熔解曲线分析技术可以分辨一个碱基的区别，已开始用于基因突变检测和SNP分型。几方面技术的进步提升了熔解曲线分析的分辨率。一是高分辨率荧光染料的发现。与传统的荧光染料不同，这些高分辨率荧光染料对DNA聚合酶的抑制作用很小，因而可以在饱和浓度下使用。这就解决了传统荧光染料在低浓度使用时由于与双链DNA解离后又在DNA分子别处结合上去，导致熔解曲线峰很宽，分辨率很低的问题。二是精密荧光PCR仪的使用。这些精密荧光PCR仪，温度控制精密，步距小，而且反应孔位之间温差很小。三是熔解曲线处理软件的进步。先进的高分辨率熔解曲线处理软件通过数据转换去伪存真，让单碱基变化造成的熔解曲线的微小变化显示出来。

要将HRM技术成功用于基因突变检测和SNP分型，除了需要满足以上提到的三个要素外（使用饱和浓度的高分辨率荧光染料，高精密度PCR仪，和卓越的分析软件），还需要精心设计引物，尽量拉开不同基因型的熔解曲线区别；优化反应体系，使得体系和不同样本对熔解曲线的影响最小化。 应用HRM方法分析成百上千个样本的几个SNP位点，具有价格优势。

PCR-RFLP方法只适应那些由于SNP位点的存在导致酶切位点变化的SNP的分型。首先通过PCR将跨越SNP位点的DNA片段扩增出来，然后用可以区分SNP位点的一个限制性内切酶酶切PCR产物。应用凝胶电泳或毛细管电泳分析酶切产物，根据酶切图谱确定基因型。

服务使用仪器

a) 组织样品（需提供≥100mg组织。）；b) 体外培养细胞（需提供≥10^6个细胞。）；c) 基因组DNA （需提供≥5ug 基因组DNA）；d) 全血（需提供≥2ml 全血）。

所有类型样品必须用冰袋寄至公司。冰块应足量，以确保样品寄至公司时，冰块未完全融化。

询价

分型结果。如需要，可提供所使用方法的原始数据。

10-20个工作日

PCR + RFLP SNP分型服务（仅适用楚天生物拥有产品的4万多个SNP）

2.接受样品类型a)组织样品（需提供≥100mg组织。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；b)体外培养细胞（需提供≥10^6个细胞。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；c)基因组DNA （需提供≥5ug 基因组DNA）；d)全血（需提供≥2ml 全血）。所有类型样品必须用冰袋寄至公司。冰块应足量，以确保样品寄至公司时，冰块未完全融化。

样品类型

服务内容

价格（人民币：元）

组织样品，体外培养细胞，全血

DNA制备，OD260,280测定， 凝胶电泳分析，SNP分型

询价

基因组DNA

OD260,280测定，凝胶电泳分析，SNP分型

询价

服务报告提交下列数据：OD260, OD280 读数；凝胶电泳分析结果； 限制性内切酶酶切结果。

收到样品后10-20个工作日。

PCR + 测序 SNP分型服务

PCR ＋ 测序 SNP分型服务采用PCR扩增跨越SNP位点的基因组片段，然后通过DNA测序确定基因型。楚天生物承接所有SNP的基因分型。

a)组织样品（需提供≥100mg组织。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；b)体外培养细胞（需提供≥10^6个细胞。必须保存在RNAlater或类似RNA保护溶液中）；c)基因组DNA （需提供≥5ug 基因组DNA）；d)全血（需提供≥2ml 全血）。所有类型样品必须用冰袋寄至公司。冰块应足量，以确保样品寄至公司时，冰块未完全融化。

样品类型

服务内容

价格（人民币：元）

组织样品，体外培养细胞，全血

DNA制备， PCR， DNA测序

询价

基因组DNA

PCR，DNA测序

询价

服务报告提交下列数据：DNA测序结果, SNP分型结果。

收到样品后10-20个工作日。

MassARRAY SNP基因型分析--打造最优性价比服务方案!

MassARRAYSNP基因分型技术是由美国Agena Bioscience, Inc.（原Sequenom Bioscience Division）公司开发的基于飞行质谱的分型技术，楚天生物为该公司（Agena Certified Service Provider Certificate）。该技术通过PCR扩增跨越SNP位点的DNA序列，然后应用单一延伸引物(extension primer)扩增PCR产物，确保延伸引物只延长一个碱基。延伸产物用飞行质谱(TOF, time of flight)进行分析，根据一个碱基的分子量差别对SNP进行分型，也可做SNP位点等位基因频率计算。MassARRAY SNP基因型分析可以进行多重SNP分型，即一个反应可同时分型多个SNP位点。该技术分析准确，在分析数十上百个SNP时具有价格优势。

MassARRAY飞行质谱检测系统基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 技术。将制备好的样品与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器，飞行时间与离子质量成正比。MALDI产生的离子用飞行时间（Time-of-Flight,TOF）检测器来检测，离子质量越小，飞行时间越短。理论上讲，只要飞行管长度足够，TOF 检测器可检测分子的质量数是没有上限的。

图1 飞行时间质谱检测物质分子量的原理

MassARRAY SNP基因型分析在生物科学、医学、农业研究和应用等多个领域具有非常好的应用前景，为全世界的科学家们提供优质的解决方案，获得了瞩目的进展。以下是一些代表文献：

图2 MassARRAY Genetic Analysis System平台示意图

所有类型样品必须用冰袋寄至公司。冰块应足量，以确保样品寄至公司时，冰块未完全融化。

SNP分型（或基因突变检测）的费用根据需要分型的SNP位点，数目以及样品数量的不同而制定。

分型结果示例。以下是MassARRAYSNP基因分型飞行质谱分析图：

图3 MassARRAYSNP基因分型飞行质谱部分分析图

如需要，可提供所使用方法的原始数据。

10-30个工作日

等位基因专一性PCR（AS-PCR）

等位基因专一性PCR的原理是根据SNP位点设计某一等位基因专一性引物，使得PCR只扩增某一个等位基因。举例说明，等位基因1和等位基因2 在SNP位点分别为C和T，设计引物时，扩增等位基因1和2的引物分别按照C或T设计，另一引物相同。在最理想情况下，扩增等位基因1的引物不能扩增等位基因2，反之亦然。但实际上由于基因专一性引物只在SNP位点相差一个碱基，二者都可能存在非特异性交叉扩增，即设计扩增等位基因1的引物可以扩增等位基因2，反之亦然。但多数情况下错配扩增的效率比完全互补扩增的效率低。

通过在SNP位点外引人额外的错配或优化PCR反应体系，可以进一步增大两者扩增效率的差别。传统的等位基因专一性PCR通过凝胶电泳来分析PCR产物，进而确定基因型。这种方法虽然经济，但出错率高。应用实时荧光PCR进行等位基因专一性PCR，分型准确。

提交数据分型结果。如需要，可提供所使用方法的原始数据。

报告提交周期收到样品后10-20个工作日。

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