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snapgene 构建载体方法分享
文章目录
snapgene 构建载体方法分享1. Snapgene 构建载体—酶切位点法2. 载体构建——同源重组法3. 总结
1. Snapgene 构建载体—酶切位点法
本文以拟南芥相关基因ATG7为例,打开Tair网页(专门的拟南芥基因库网站),找到基因那一栏,输入目标基因后得到结果。从图中可以看到描述这一栏写的这个基因的名称,其中就包括了ATG7。确认基因后点击目标基因。
从Star开始CSD序列前25个左右碱基,此时注意温度最好在60度左右(22-40碱基数目之间都可以),点击Primers>add primer>top strand,点OK。 从END开始CSD序列后25个左右碱基,此时注意温度最好在60度左右(22-40碱基数目之间都可以),但也要兼顾碱基的长度,如果太长则不好扩增PCR。点击Primers>add primer>bottom strand,点OK. 这一步先做到这,后续再添加酶和碱基。 点击Emazy>choose emazy>先移除右边框中的酶,然后再添加你所在实验室中已有的酶,我在这里随便选了6种。如下图所示,然后点确定。 我的示例图中添加的碱基G。如下图所示: 得到如下结果后点击保存文件。
也能通过插入的片段完整来验证实验成功(图中圆圈标记位置)。 2. 载体构建——同源重组法 还是以基因ATG7为例,首先在NCBI, TAIR等基因网站找到这个基因,复制CDS序列。将序列插入new dna file,然后重命名文件。选中全长后,点击Features> add feature>label name 改为CDS> type 改为CDS。这样的目的是为了方便后续检测基因是否插入成功。查看实验室已有的酶,点击Emazy>choose emazy>先移除右边框中的酶,然后再添加你所在实验室中已购买的酶。保存文件为ATG7.dna文件。后续要在载体中插入到这个文件所以要先保存。打开载体文件, 找到到多酶切位点序列。查看哪些酶切位点可用且不会切到基因片段,然后确定酶切位点,可用一个酶,也可以用两个酶,不过最好选两个酶。(步骤5-6的详细介绍参考上文的酶切位点法步骤9-12)在载体文件中选择要两个酶切位点,点击Action>In-fusion cloning> Insert fragment![]() ![]() ![]() ![]() ![]() 同源重组法比双酶切酶位点法要简单很多,步骤也要少的多,但假阳性率略高。 不过从实践经验来看,同源重组挺好用,比较推荐。 |
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