本发明涉及一种糖肽化合物的分离纯化方法，着重阐述了唾液酸糖肽的分离纯化，属于生物化学技术领域。

背景技术：

唾液酸糖肽(sialylglycopeptides,sgp)是一种从新鲜鸡蛋黄中提取到的具有天然复杂型n糖链的糖肽，由十一个单糖与六个氨基酸组成，其非还原末端通常为两个唾液酸，又称为双唾液酸糖肽(其结构如下所示)。

sgp有许多重要的生物活性，如可以作为拮抗剂抑制细菌及病毒与宿主细胞的结合，在抗菌方面可以抑制沙门菌等细菌与人类肠道细胞与小鼠组织细胞的结合。sgp中唾液酸化的α-(2→6)n-乙酰氨基乳糖残基还可以作为配体与a型人流感病毒血凝素结合，由此抑制流感病毒与宿主细胞的结合。因此，sgp有着成为良好抗菌、抗病毒预防类药物的潜力。更为重要的是由于糖链合成的困难，sgp中的糖链可以作为糖基供体，用于合成带有n-糖链的亲脂类化合物、糖簇的合成，还可以将该糖链连接到带有glcnac的糖蛋白或糖肽上，合成新的糖蛋白和糖肽。随着唾液酸糖肽在糖蛋白合成和修饰等领域的广泛应用，该糖肽的制备和生产引起了糖生物学领域的关注。

目前，制备sgp的方法主要有2种。第一种是1997年日本akiraseko[1]首次报道的从鸡蛋黄中分离纯化唾液酸糖肽的方法，也是目前主要的sgp制备方法。该方法对蛋黄进行苯酚处理后，经过两次sephadexg-50分离，经sephadexg-25除盐、再经deae-toyopeael650m离子交换柱纯化，最后sephadexg-25除盐后冻干得到样品,后期该实验室在纯化方面做出了进一步改进提出用高效液相色谱(hplc)对sgp进行纯化，但用上述方法纯化sgp时，具有步骤多，成本高，周期长，样品损失较大，上样量少等缺点。第二种方法是yangzou[2]报道的。他们先用苯酚处理新鲜的鸡蛋卵黄，去除蛋白，再用sephadexg-50进行分离，最后用活性炭柱进行纯化和脱盐，该方法虽然简化了一些步骤，但周期相对本发明方法仍然较长，柱填料成本较高。

因此开发一种成本低廉、周期短、步骤少、效率高的sgp大规模分离纯化方法显得尤为迫切和必要。

[1]sekoa,koketsum,nishizonom,etal.occurrenceofasialylglycopeptideandfreesialylglycansinhen'seggyolk[j].biochimbiophysacta,1997,1335:23-32.

[2]zouy,wuz,chenl.anefficientapproachforlarge-scaleproductionofsialyglycopeptidesfromeggyolks[j].jcarbohydrchem,2012,31:436-446.

技术实现要素：

针对现有唾液酸糖肽分离技术中存在的步骤多、周期长、成本高等缺点，本发明的目的是提供一种周期短、成本低、效率高的分离、纯化制备唾液酸糖肽(sgp)的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

该方法包括以下步骤：

(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；

(2)取脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；

(3)取步骤(1)得到的唾液酸糖肽粗品配置溶液，加到步骤(2)得到的棉花亲水色谱柱上，并作干燥处理；

(4)对步骤(3)得到的棉花亲水色谱柱用浓度75％以上的乙腈水溶液洗脱除盐和杂质；

(5)最好用纯水将糖肽洗脱，冻干得到唾液酸糖肽的纯品。

基于以上方案，本发明还进一步作了如下优化：

步骤(2)中，将脱脂棉均匀装填后，依次采用纯水和乙腈分别清洗，然后在烘箱里烘干，温度优选50-60℃，得到棉花亲水色谱柱。

步骤(3)中，冻干的唾液酸糖肽样品溶于水中，配成浓度为100-150mg/ml的溶液。

步骤(4)采用100％、95％、85％、75％的乙腈水溶液进行梯度洗脱；或者采用75％-90％的乙腈水溶液持续洗脱。

若以棉花亲水色谱柱容积1ml计，则装填的脱脂棉为150mg，步骤(3)中上样的唾液酸糖肽粗品配置溶液为500ul，步骤(4)中乙腈水溶液总用量为40-60ml(若采用梯度洗脱，各梯度用量优选10-15ml)，步骤(5)中纯水用量为4ml。根据需要，可相应增加用量。

所述的脱脂棉优选医用脱脂棉。

在步骤(3)中，唾液酸糖肽粗品的溶液加入棉花柱前，先以12000rpm离心3min除去不溶物。上样过程中避免液体从柱中流出，并及时干燥。

在步骤(1)中，新鲜鸡蛋黄的处理方法是：取新鲜未受精的鸡蛋黄，加入等体积的水使之搅拌均匀。为了达到变性的目的，加入十倍体积的苯酚水溶液(水：苯酚＝9:1)，持续搅拌2h，然后加入2l的纯水，4500g离心30min，上清置于旋转蒸发仪中减压浓缩，并冻干处理，得到唾液酸糖肽粗品。

本发明省略了现有技术中sephadexg-50分离，sephadexg-25除盐、离子交换色谱纯化等繁琐步骤，反应条件温和，降低了实验成本、缩短了纯化周期、提高了效率。具体有以下有益效果：

1、本发明利用了脱脂棉含有大量羟基，具有强亲水性的特性，制作棉花亲水色谱柱，并通过简单的洗脱操作即可获得唾液酸糖肽纯品，收率较高且纯度达95％以上。

2、由于脱脂棉的成本较低，且制作棉花亲水色谱柱以及洗脱环节非常简便，因此大大降低了整体成本。

3、洗脱条件温和，不再加入三氟乙酸或甲酸，防止了唾液酸脱落。

4、缩短了纯化周期，从上柱到获得最终的唾液酸糖肽产品，前述现有技术(第二种)通常需要两周时间，而本发明只需要两天的时间。

5、不仅适用于实验室制备，也可用于工业生产(只需配置常规的反应罐，增加棉花的填入量即可)。

附图说明

图1：纯化前和纯化后糖肽的质谱图；

其中：负离子模式检测唾液酸糖肽，953.9为样品三电荷峰，1431.3为样品双电荷峰，与唾液酸糖肽2866分子量吻合。结构式中的■表示n-乙酰葡萄糖胺、●表示高甘露糖、○表示半乳糖、◆表示唾液酸。

图2：唾液酸糖肽经过pngasef酶切后肽段的质谱图(正离子模式)。

图3：肽段的ms2质谱图。

图4：hplc检测唾液酸糖肽样品图谱；

其中：柱子：c18柱；流动相：10％乙腈水溶液(含0.1％tfa)；流速：0.8ml/min；检测波长：214nm.

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作详细的介绍。

新鲜未受精鸡蛋购买于当地农贸市场；医用脱脂棉购买于校医院；糖苷酶(pngasef)购买于biolabs公司；c18柱(固相萃取小柱sep-pakc18，100mg/1ml)购于waters公司；固相萃取小柱多孔石墨碳柱(150mg/4ml)购于alltechassociates公司；lc-2010a高效液相色谱仪(hplc)购买于shimadzu公司；十二烷基硫酸钠(sds)、二硫苏糖醇(dtt)、np-40均购于aladdinindustrialinc公司；色谱纯乙腈购于fisherscientific公司；双蒸水是实验室用自动双重纯水蒸馏器进行制备得到；其它试剂均为分析纯。

本发明中质谱鉴定使用电喷雾电离线性离子阱质谱(ltqxl，thermoscientific，usa)检测。

esi-ms参数设置如下：进样量，2μl进样环控制；载样流动相为甲醇/水(50％/50％，v/v)；流速为50μl/min；工作电压为4kv；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37v；毛细管透镜电压是250v；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用ltqtune软件。

多级质谱(msn)检测参数设置为：进样量，2μl进样环控制；载样流动相为体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μl/min；工作电压为4kv；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37v；毛细管透镜电压是250v；毛细管温度是300℃；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；碰撞气体是氦气；同位素宽度m/z3.00；离子碰撞能量是35％～45％；激活电荷是0.25；激活时间是30ms。

实施例1：

具体步骤如下：

(1)首先取50个新鲜未受精的鸡蛋蛋黄(1l)，加入等体积的去离子水进行稀释，并用转子搅拌均匀。为了达到变性蛋白的目的，向上述蛋黄溶液中加入十倍体积的苯酚水溶液(水:苯酚＝9:1),持续搅拌2h，然后加入2l的双蒸水混匀后离心(4500g，30min),将上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至50ml，转移到250ml圆底烧瓶中，再将烧瓶置于-80℃冷冻1h，然后将冷冻后样品放入真空冷冻干燥机进行干燥处理。

(2)取医用脱脂棉150mg均匀塞进1ml的枪头中，并轻微压实，用10ml双蒸水清洗棉花柱，接着用10ml100％乙腈清洗棉花柱。将清洗干净的棉花柱进行干燥处理，放置烘箱中50℃干燥8h。

(3)将冻干的唾液酸糖肽粗品配置成100mg/ml的溶液，12000rpm离心3min，除去不溶物。取上清500ul加入干燥好的棉花柱中，防止液体流出。将棉花柱放置-80℃冷冻30min，取出放在真空冷冻干燥机中进行干燥处理4h。

(4)用100％、95％、85％、75％乙腈水溶液各10ml进行清洗棉花柱，除去多余的盐和杂质。

(5)用4ml的纯水洗脱唾液酸糖肽，将洗脱液转移至圆底烧瓶中，将烧瓶放置-80℃冷冻1h，再将冷冻后的样品放入真空冷冻干燥机中干燥处理12h后，得到唾液酸糖肽的纯品。

(6)对得到的唾液酸糖肽进行结构鉴定和纯度鉴定

取1mg样品溶于50ul水中，取10ul进行esi-ms检测负离子模式(结果如图2所示)，样品分子量与理论值吻合。

取5mg糖肽样品，溶于450μl双蒸水中，加入50μl蛋白质变性液(蛋白质变性液的配制方法：50mgsds和62mgdtt溶于1ml双蒸水中)，在100℃加热变性10min。待样品冷却到室温时，加入50μl酶解缓冲液(酶解缓冲液的配制方法：1.9g磷酸钠溶于10ml双蒸水中，用磷酸调ph到7.5)、50μlnp-40(10％，v/v)和1μlpngasef酶，37℃反应24h。待反应结束，100℃灭活5min，减压浓缩后将样品重溶于1ml双蒸水中，依次经过c18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱的纯化。

c18固相萃取柱纯化过程为：c18固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将待纯化样品上样，10倍柱体积双蒸水洗脱(唾液酸糖肽经pngasef酶后肽段部分在c18柱上不保留)。

石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用3倍柱体积乙腈活化，再用10倍柱体积双蒸水平衡，然后将经c18固相萃取柱纯化后的样品上样，上样后先用10倍柱体积双蒸水洗脱除盐，然后，用3ml25ml/100ml乙腈水溶液(乙腈的体积分数为25％，溶剂为水)进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩进行esi-ms2分析，(结果如图3所示)，肽段的氨基酸序列与理论值吻合。

用hplc进行纯度检测，其中柱子选用反向c18柱；流动相：10％乙腈(含0.1％tfa)；流速0.8ml/min；检测波长：214nm，(结果如图4所示)，纯度可达95％以上。

用上述方法，可以从50个鸡蛋黄中，分离纯化出300mg纯度95％的唾液酸糖肽。

实施例2：

具体步骤如下：

(1)首先取50个新鲜未受精的鸡蛋蛋黄(1l)，加入等体积的去离子水进行稀释，并用转子搅拌均匀。为了达到变性蛋白的目的，向上述蛋黄溶液中加入十倍体积的苯酚水溶液(水:苯酚＝9:1),持续搅拌2h，然后加入2l的双蒸水混匀后离心(4500g，30min),将上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至50ml，转移到250ml圆底烧瓶中，再将烧瓶置于-80℃冷冻1h，然后将冷冻后样品放入真空冷冻干燥机进行干燥处理。

(2)取医用脱脂棉150mg均匀塞进1ml的枪头中，并轻微压实，用10ml双蒸水清洗棉花柱，接着用10ml100％乙腈清洗棉花柱。将清洗干净的棉花柱进行干燥处理，放置烘箱中60℃干燥8h。

(3)将冻干的唾液酸糖肽粗品配置成150mg/ml的溶液，12000rpm离心3min，除去不溶物。取上清500ul加入干燥好的棉花柱中，防止液体流出。将棉花柱放置-80℃冷冻30min，取出放在真空冷冻干燥机中进行干燥处理4h。

(4)用75％乙腈水溶液60ml进行清洗棉花柱，除去多余的盐和杂质。

(5)用4ml的纯水洗脱唾液酸糖肽，将洗脱液转移至圆底烧瓶中，将烧瓶放置-80℃冷冻1h，再将冷冻后的样品放入真空冷冻干燥机中干燥处理12h后，得到唾液酸糖肽的纯品。

(6)对得到的唾液酸糖肽进行结构鉴定和纯度鉴定

取1mg样品溶于50ul水中，取10ul进行esi-ms检测负离子模式，样品分子量与理论值吻合。

取5mg糖肽样品，溶于450μl双蒸水中，加入50μl蛋白质变性液(蛋白质变性液的配制方法：50mgsds和62mgdtt溶于1ml双蒸水中)，在100℃加热变性10min。待样品冷却到室温时，加入50μl酶解缓冲液(酶解缓冲液的配制方法：1.9g磷酸钠溶于10ml双蒸水中，用磷酸调ph到7.5)、50μlnp-40(10％，v/v)和1μlpngasef酶，37℃反应24h。待反应结束，100℃灭活5min，减压浓缩后将样品重溶于1ml双蒸水中，依次经过c18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱的纯化，纯化方法与实施例1相同，肽段的氨基酸序列和理论值吻合。

用hplc进行纯度检测，其中柱子选用反向c18柱；流动相：10％乙腈(含0.1％tfa)；流速0.8ml/min；检测波长：214nm，纯度可达95％以上。

用上述方法，可以从50个鸡蛋黄中，分离纯化出280mg纯度95％的唾液酸糖肽。

通过多例洗脱实验，确定了75％以上的乙腈水溶液均可得到令人满意的结果。当乙腈浓度低于75％时，样品会损失。

需要说明的是，上述实施例所列具体操作方式和参数并非对本发明方案的限制，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。