|
大肠杆菌表达实验标准操作流程（SOP）蛋白表达专题资料感受态细胞制备流程和原理大肠杆菌蛋白表达系统实验原理和目的原理：将外源基因插入质粒或其他载体，再导入活的宿主细胞，使外源基因高效表达，获得所需的蛋白质。大肠杆菌蛋白表达原理及IPTG诱导原理详细内容请访问：原核表达IPTG诱导原理。实验试剂质粒感受态细胞TE：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0LB:试管4ml；固体平板抗性：A+（100mg/ml）; K+（50mg/ml）; CI–保种甘油：C=80% V=100mlIPTG1 x PBS2 x Loading BufferDDH2O实验仪器冰箱（4℃）超低温冰箱（-80℃）水浴锅（42℃）摇床（37℃；195r)培养箱（37℃）可见分光光度计（OD600;OD=0.6-0.8）离心机（6000r/min)煮样器（100℃；25min)详细实验步骤表达鉴定第一天的任务，常用抗性选择根据感受态细胞选择拿到质粒，离心（3000r/min；2min)在质粒中加入TE【使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng，据此确定加入TE的量】，一般为（1μg质粒加20μLTE；2μg质粒加50μLTE；5μg质粒加100μL TE）将质粒与TE混匀，吸取2μL混液与感受态细胞混匀将感受态细胞放入冰箱（4℃）中，30min取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,再次放入冰箱（4℃）中，3min拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中放入摇床（37℃; 195r) 中, 30nim至60min; （最佳45min）取出离心（3000r/min；2min)去掉200μL的上清，留100μL左右上清悬浮沉淀，吸取50μL悬液涂平板，【先将对应抗性的平板放入培养箱（37℃）中预热20min】把平板放入培养箱（37℃），过夜（12h至16h） 2. 表达鉴定第二天的任务，注意Pcold表达载体的表达温度 每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的LB（4ml）试管中，编号为“0”“1”“2”“3”将试管放入摇床（37℃；195r) 中，【单抗性3h左右；双抗性4左右；刚开始用可见分光光度计测OD值；熟练后可目测（背光下，以试管中的枪头为例，刚刚看不见枪头即可）】，测OD值（0.6至0.8）从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀，放入冰箱（-20℃）冻存在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG【终浓度0.5mM最适，可根据日后表达摸索】视不同的载体选择适合的表达环境【PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6h；37℃表达3h至4h（4支试管，“0”“1”号试管15℃表达过夜；“2”“3”试管37℃表达3h至4h）。Pcold：【全部15℃表达过夜】3. 表达鉴定第三天，全菌的表达鉴定分析，注意控制溶质的量及溶液黏度 从每组4支的试管中均取500μL菌液加入到1.5ml离心管中，【若OD值不一样，值小的可多取】离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液离心，尽量使沉淀量接近】在每个离心管中加入500μL的DDH2O,悬浮沉淀，离心（6000r/min)，5min, 去上清，留沉淀在每支离心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer悬浮沉淀【当溶质适量且均一的情况下，加入量不变；当溶质多且粘稠时，应使加入量增大，为降低粘度也可减少上液量】放入煮样器（100℃） 25min取出后离心（6000r/min) 3min, 电泳检测。蛋白表达量不错，进行蛋白纯化；蛋白表达量低或者没表达，可参考原核表达FAQ相对应解决方案解决。4. 蛋白纯化：见蛋白纯化专题
|