实验目的

1.

了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况

2.

学会用

SDS-PAGE

电泳法分离不同分子量的蛋白质

3.

学习通过亲和层析法纯化目的蛋白

4.

学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质

实验原理

1.

外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：

将外源基因克隆在特殊的表达载体中，

让其在

E. coli

中表达，该表达载体上含有

lac

操作子的启动子。在不加诱导剂的

条件下培养宿主菌，

lacI

基因表达的阻遏蛋白

LacI

与

lac

操作子结合，使外源基

因不能表达；向培养基中加入诱导物

IPTG

后，

LacI

阻遏蛋白变构失活，不能与

lac

操作子结合，外源基因就表达。

2.

蛋白质

SDS-PAGE

电泳分离：

SDS-PAGE

是最常用的定性分析蛋白质的电泳方

式，

特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

其分离原理是根据蛋白质

分子量的差异，

因为

SDS-PAGE

的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二

级、三级、四级等结构，并使

SDS

与蛋白质充分结合形成

SDS-

蛋白质复合物，稳

定地存在于均一的溶液中，

SDS

与蛋白质结合后使

SDS-

蛋白质复合物上带有大量

的负电荷，

远远超过其原来所带的电荷，

从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略

不计，

消除了不同分子之间原有的电荷差别，

其电泳迁移率主要取决于亚基分子

质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.

考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝

是一种蛋白质染料，主要有

R-250

和

G-250

两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸

残基（

Arg

，

Trp

，

Tyr

，

His

，

Phe

）结合。考马斯亮蓝

R250

多用于聚丙烯酰

胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；

因为考马斯亮蓝

R250

中的

R

代表

Red

，

偏红，

红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染

色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4.

基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，

融合阅读框架

的表达产物是一个杂和蛋白。

在

E. coli

的

pET

表达系统中表达

N

端含有

His-tag

（组氨酸六聚体）的融合靶蛋白，然后用亲和层析的方法进行纯化。

多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，

因此带暴露的

6 X His-tag

的蛋白质能结合于固化

Ni2+

树脂，从而将带有

his-tag

组氨酸标签的融合蛋白与

其它蛋白区分开来。组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与

Ni

离子作用的关键。当

我们用高浓度的咪唑

（

imidazole

）

溶液洗脱的时侯，

咪唑便与融合蛋白

his-tag

的

咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白洗脱下来。

5.

蛋白质杂交法：蛋白质杂交也称

Western blotting

，首先是要将电泳后分离的蛋

白从凝胶中转移到

PVDF

膜上，

本实验使用电泳印迹湿转法。

这种方法是用有孔

的塑料和泡沫将凝胶和

NC/PVDF

膜夹成

“

三明治

”

形状，而后浸入两个平行电极