技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测免疫性坏死性肌病血清抗HMGCR抗体的方法。

背景技术

特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies,IIM)是一组以侵害骨骼肌为主的系统性自身免疫性肌病，自身免疫的异常是IIM的发生、发展的关键。根据欧洲神经肌肉疾病中心和美国肌肉研究协作组最近的诊断分类标准，IIM可分为多发性肌炎(polymyositis,PM)、皮肌炎(dermatomyositis,DM)、免疫介导的坏死性肌炎(immune-mediated necrotizing myopathy,IMNM)、非特异性肌炎(nonspecific myositis,NSM)和包涵体肌炎(inclusion body myositis,sIBM)，并将肌炎自身抗体作为其他实验室检查的一项加入诊断标准。这表明肌炎自身抗体对IIM的诊断、分型、治疗和预后有重要意义。IIM临床特点表现为四肢近端肌无力，特征性皮疹、系统性损害以及血清中存在多种自身抗体，这些自身抗体与临床表型密切相关。

其中坏死性肌病(necrotizing myopathy)是一组以亚急性或隐匿起病、对称性近端肌无力、血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)升高、肌源性损害肌电表现，磁共振成像(MRI)以肌肉水肿为主，肌肉病理提示大量变性、坏死、新生肌细胞，少见炎症细胞浸润为特点的疾病统称，可由自身免疫、中毒、肿瘤、内分泌异常等疾病引起，易与肌营养不良混淆。其中自身免疫性坏死性肌病(autoimmune necrotizing myopathy)是唯一激素治疗有效的坏死性肌病。

他汀类药物是治疗高胆固醇血症的首选药物，主要分为天然化合物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和完全人工合成化合物(如氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、pitavastatin)是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。一般情况下将其分为三类，使用方法用对见效非常快，所以一般使用他汀类药物具有抑制人体合成胆固醇、降低血中甘油三酯浓度的作用。他汀类药物(statins)，是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。

近年来，他汀类药物在临床的应用日益增多。然而，他汀类药物导致的肌肉不良反应是限制其使用的主要原因之一。多数患者表现为他汀类药物相关自限性肌病，其临床特点多样化，轻者可出现无症状血清CK增高、肌肉沉重感、僵硬、无力、疼痛、运动耐量下降等症状，但是在停用他汀类药物后，肌肉症状及血清CK会在数周至数月逐渐恢复正常；极少数严重者会出现横纹肌溶解，此症状患者需要住院治疗。

罹患自身免疫性肌病，患者轻者可出现肌肉沉重感、僵硬、无力、疼痛、运动耐量下降，丧失劳动力等症状，重则可出现横纹肌溶解，进而严重影响患者的身体健康和生活，甚至危及患者生命。若不及时诊断治疗，会增加患者的致残率和致死率。若上述症状能够得到及时准确的诊断，则对于患者的治疗乃至预后恢复具有重要的意义。

在肌病诊断中，肌活检的组织化学检查虽然具有决定性的诊断意义，但是自身抗体的检测也至关重要，肌炎特异性自身抗体与临床表现和预后的高度相关性已受到广泛关注。与肌炎相关的自身抗体分为两类：肌炎特异性自身抗体和肌炎相关性自身抗体，二者可作为血清学检测方法的实施对象，弥补组织学检测的不足。在免疫介导的坏死性肌炎患者中，检测特异性抗体可区分缓慢进展的获得性坏死性肌病与肌营养不良，从而可以尽早的给予针对性有效治疗。

来自欧洲6个研究中心的数据表明，有3％～6％的特发性炎性肌病患者血清抗SRP抗体阳性，而国内患者这一比例高达13％。研究显示，血清抗SRP抗体与免疫性坏死性肌病相关，约20％患者血清抗SRP抗体阳性。近年新发现的一系列肌炎特异性抗体均与免疫性坏死性肌病和重症皮肌炎有关，如Christopher-Stine等和Watanabe等在免疫性坏死性肌病患者血清中发现相对分子质量为200×10

作为特发性炎性肌病的亚型，免疫性坏死性肌病可由肿瘤、急性病毒感染、他汀类调脂药或自身免疫等多种因素引起，而血清抗HMGCR抗体主要见于他汀类调脂药导致的免疫性坏死性肌病患者，而在服用他汀类调脂药但无肌肉损害或自限性他汀相关性肌病患者中未见该抗体。因而抗HMGCR抗体与他汀类调脂药密切相关，是他汀类调脂药介导的免疫性坏死性肌病的特异性抗体。抗HMGCR抗体介导的坏死性肌病有其独特的临床及辅助检查特点，该病症具有对称性近端肌无力、部分伴肌肉疼痛、吞咽困难等特点，血清肌酸激酶(CK)水平达正常参考值上限10倍以上；肌电图呈肌源性损害、肌肉MRI显示肌肉水肿、肌肉组织活检术可见以肌细胞坏死和再生为主，伴或不伴轻度炎性细胞浸润、肌细胞胞膜可见弥漫性或多灶性主要组织相容性复合物I(MHC.I)表达上调需糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗，且抗HMGCR抗体可用于疗效评价和随访研究。

由上述内容可知，检测患者血清中抗体对该肌病的诊断具有重要意义。在国家药品食品监督管理局网http://www.sda.gov.cn中的医疗器械条目中输入“抗HMGCR/SRP自身抗体”进行体外诊断试剂检索，结果显示为“0”条目符合要求，意味着至今我国虽然有临床需求，但是没有符合相关标准的相应体外诊断试剂。因此，研制我国自身免疫性坏死性肌病抗体体外诊断试剂既有显著的社会效益，同时蕴含了巨大的经济效益。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测免疫性坏死性肌病抗HMGCR抗体的方法，该检测方法具有灵敏度高的特点。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种检测免疫性坏死性肌病抗HMGCR抗体的方法，包括以下步骤：

S1：获取HMGCR基因；

S2：构建pSJMY-mCherry重组荧光标签载体；

S3：将步骤S1得到的HMGCR基因与步骤S2得到的重组荧光标签载体结合，构建重组表达载体pSJMY-H-mCherry；

S4：将步骤S3得到的重组表达载体pSJMY-H-mCherry转染细胞，然后将转染细胞中表达得到的HMGCR蛋白抗原与待测血清进行免疫反应，用于检测待测血清中是否存在抗HMGCR抗体。

进一步地，所述S1包括以下步骤：

1)从患者组织中提取总RNA，以总RNA为模板反转录得到总cDNA；

2)从NCBI中获取HMGCR序列并分为前片段和后片段，设计相应的正向引物和反向引物，PCR扩增步骤1)得到的cDNA得到对应的HMGCR基因；

3)将步骤2)得到的HMGCR基因的前后两个片段分别与T载体进行TA克隆，将连接产物转化到感受态细胞中进行转化，得到转化子；

4)挑取步骤3)的转化子进行培养。

进一步地，所述步骤2)HMGCR序列的前片段的正向引物为GGGGCGATCGCCATGTTGTCAAGACTTTTTCGA，前片段的反向引物为TTTGCTGAGGTAGTAGGTTGGTCCACCACCCACCGTTCCTATCTCTATAGATGGCAT；HMGCR序列后片段的正向引物为TTTCCTCAGCAAGCCTGTTTGCAGA，后片段的反向引物为AAAACGCGTGGCTGTCTTCTTGGTG。

进一步地，所述S2包括以下步骤：

5)利用引物对将mCherry红珊瑚蛋白基因进行PCR扩增；

6)将步骤5)得到的mCherry红珊瑚蛋白基因与载体pS100010构建pSJMY-mCherry重组荧光标签载体。

进一步地，所述步骤5)中mCherry红珊瑚蛋白基因的正向引物为TACGCGGCCGCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGG，反向引物为CGCGGCCGGCCGTTTAAACCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC。

进一步地，所述S3包括以下步骤：

7)选取步骤4)得到的前、后片段测序均正确的转化子进行重新组合，将前后片段分别从T载体上切胶回收，与步骤6)得到C端含有mCherry红色珊瑚蛋白荧光的空载体pSJMY-mCherry连接得到pSJMY-H-mCherry，并将连接产物转化大肠杆菌，得到转化子；

8)以HMGCR前片段的正向引物和HMGCR后片段的反向引物对步骤7)得到的转化子进行菌落PCR扩增，确定阳性菌落；

9)将步骤8)得到的阳性菌落扩大培养及酶切鉴定。

进一步地，所述S4包括以下步骤：

10)接种HEK293 T细胞至培养系统中，细胞达80％浓度时将步骤9)得到的pSJMY-H-mCherry载体与转染试剂共同转入细胞，进行载体转染，得到含重组表达载体pSJMY-H-mCherry的细胞；

11)将步骤10)得到转染载体细胞，进一步进行固定、破膜、包被、封闭；

12)向步骤11)得到的细胞表达的HMGCR蛋白抗体中添加待测血清，进行免疫反应检测。

进一步地，所述步骤12)的过程包括：

12.1)将血清标本进行比例稀释；

12.2)弃去步骤11)得到的细胞表面的封闭液，加入步骤12.1)的稀释血清，得到混合均匀混合液并进行孵育；

12.3)将步骤12.2)中混合液弃去，并向其中加入含Triton的PBS洗液洗涤，然后加入对应的二抗孵育，孵育完成后用含Triton的PBS洗液洗涤；

12.4)向步骤12.3)得到的物质中加入磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种检测免疫性坏死性肌病血清抗HMGCR抗体的方法，该检测方法首先获取得到HMGCR基因，并通过分子生物学方法与重组荧光标签载体构建成功含红珊瑚荧光蛋白的pSJMY-H-mCherry载体，并将上述载体瞬时转染HEK293T细胞，然后将细胞中表达HMGCR蛋白抗原与待测血清及对应的二抗进行免疫反应。本发明利用红色荧光蛋白基因构建的双色间接免疫荧光检测人体内抗HMGCR抗体，具有灵敏度高的特点，对患者的早期诊断和疗效评价均有明确的指导意义，具有显著的社会效益和巨大的经济效益。

附图说明

图1为本发明HMGCR前片段、后片段PCR结果琼脂糖凝胶电泳图，其中图1A表示HMGCR前片段，图1B表示HMGCR后片段，图中箭头表示扩增的HMGCR前片段、HMGCR后片段的大小及位置；

图2为本发明HMGCR前片段、后片段基因测序结果图；

图3为本发明红珊瑚荧光蛋白基因mCherry的PCR结果琼脂糖凝胶电泳图，图中箭头表示扩增的mcherry基因的大小及位置；

图4为本发明pSJMY-mCherry荧光标签载体及其限制性酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中M1/M2：DL15000/DL2000，图中1、3泳道表示pSJMY-mCherry荧光载体，2、4泳道表示双酶切pSJMY-mCherry荧光载体；

图5为本发明pSJMY-mCherry荧光载体和HMGCR双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，其中图5A为HMGCR双酶切，箭头所示为胶回收片段；图5B中为1号泳道为pSJMY-mCherry荧光载体，2号泳道为pSJMY-mCherry荧光载体双酶切，箭头所示为胶回收线性载体；

图6为本发明pSJMY-H-mCherry转化子单克隆菌落的PCR结果琼脂糖凝胶电泳图，其中6A表示挑取1-10个转化子后第一步扩增mcherry的结果：M：DL2000，N:Negativecontrol，P:Positive control，1-10为pSJMY-H-mCherry转化子单克隆菌落；6B表示6A中的5-9号转化子进行第二部扩增HMGCR结果；M：DL15000，N:Negative control，P:Positivecontrol，5-9为pSJMY-H-mCherry转化子单克隆菌落；

图7为本发明pSJMY-H-mCherry载体的限制性酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中M：DL10000，1-5分别为质粒pSJMY-H-mCherry，单切pSJMY-H-mCherry，双切HMGCR-mcherry、双切HMGCR、单切HMGCR；

图8为本发明HMGCR蛋白表达鉴定Western Blot结果图；

图9为本发明pSJMY-H-mcherry检测血清抗HMGCR抗体的荧光图像。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。若无特别说明，多数分子实验均按照常规实验条件，如Sam Brook等分子克隆实验手册或者按照试剂厂家说明书建议的条件进行。

实施例

本发明检测免疫性坏死性肌病血清抗HMGCR抗体实验流程图如图1所示。

S1：获取HMGCR基因

本发明所用免疫性坏死性肌病患者的人肌肉组织来自河南省人民医院，患者知情样本的用途并签署知情同意书。

1)提取人肌肉组织总RNA及获得总cDNA

取新鲜人肌肉组织0.1-0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的1mL Trizol液于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s以充分研碎组织；然后将细胞悬浮液吸入另一1.5mL规格的Ep管中，于室温下静置5min；之后加入200μL氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min；4℃下10000r/min离心15min，离心后样品分为三层，吸取内含RNA的最上层无色水相转移至另一Ep管中；向该管中加入加入500μL异丙醇，混匀并室温静置10min，再次在4℃下10 000r/min离心10min获得RNA沉淀；弃去上清液，用用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀物，并于4℃下7500r/min离心5min；弃上清液，室温干燥15min；向干燥过的沉淀物中加入200μlDEPC处理水(无核水)溶解沉淀物，于-20℃保存备用。采用多功能酶标仪检测上述步骤得到的RNA浓度及纯度。并用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

使用PrimeScript RT试剂盒反转录合成cDNA，按表1所示成分配制反应液。

表1

将上述反应液轻柔混匀后，进行反转录反应，条件如下：首先在37℃下反应15min，接着在85℃下反应5s，并于4℃搁置，最终得到cDNA。

2)从NCBI中获取HMGCR序列并分为前片段和后片段，设计相应的正向引物和反向引物，PCR扩增步骤1)得到的cDNA得到对应的HMGCR基因；

NCBI上关于HMGCR相关信息如表2所示：

表2

从NCBI网站上查找并下载分析HMGCR序列，本发明选择将HMGCR基因从中分为前片段和后片段分别扩增，相应的正向引物和反向引物如表3所示，扩增过程送上海生工生物工程有限公司合成。

表3

3)将步骤2)得到的HMGCR基因的前后两个片段分别与T载体进行TA克隆，将连接产物转化到感受态细胞中进行转化，得到转化子：

其中TA克隆包括以下步骤：首先按照表4配制TA克隆的连接体系，连接体系配制完成后将连接液置于16℃连接30min-1h。

表4

将上述TA克隆连接体系转化大肠杆菌DH5a，方法如下：

3.1)将含Amp的LB抗性平板取出室温静置；

3.2)取上述10μL TA连接液加入到含有感受态细胞DH5a的Ep管中，冰浴静置30min；

3.3)将步骤3.2)的Ep管置于42℃水浴热激90s，再冰浴2min；

3.4)向步骤3.3)的Ep管中加入800μL培养基混匀，在37℃温和水浴60min，得到转化菌液；

3.5)取步骤3.4)的转化菌液200μL均匀涂布在步骤3.1)的LB平板上，静置5-10min，将平板与37℃倒置培养过夜，次日早上观察抗性平板，挑选菌落进行后续实验。

4)挑取步骤3)的转化子进行培养，提取质粒，并进行目的基因PCR及测序鉴定：

将步骤3)得到的抗性平板上挑取部分转化子菌落加入到含Amp的LB液体培养基中，于37℃的水平空气摇床中180-200rpm培养16h。

4.1)提取质粒：待菌液培养后，通过碱裂解法提取质粒。质粒小提(质粒小提试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司)的方法如下：

4.10)将吸附柱CP3置于收集管中，向吸附柱CP3中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

4.11)取1-5mL过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm离心1min，去上清；

4.12)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(含RNase A)，使用移液器充分混匀，悬浮细菌沉淀；

4.13)向步骤4.12)的离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分混匀，获得澄清的裂解液；

4.14)向步骤4.13)的离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min；

4.15)将步骤4.14)得到的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，保证没有吸出沉淀。以12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

4.16)向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，以12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；

4.17)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(确认已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；重复一次；

4.18)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。需要注意的是漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验，为确保下游实验不受残留乙醇的影响，需将吸附柱CP3开盖置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

4.19)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

需要注意的是洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小会影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有较大影响。若后续做测序，需使用ddH

因本发明所提质粒是大小接近于10kb的大质粒，所以在提取过程中需加大菌体使用量，使用5-10mL过夜培养菌液，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液EB应在65-70℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

4.2)目的基因PCR：目的基因PCR的扩增体系及条件如下：表5为配制的反应液。

表5

PCR反应条件设置如下：

步骤1.95℃，2min；

步骤2.94℃，30s；

步骤3.54-60℃，30s；

步骤4.72℃，30s-2min30s；

步骤5.Go to 2,30cycles；

步骤6.72℃，5min；

步骤7.Hold 4℃，5-10min；

步骤8.End。

PCR反应结束后，取1-3μL PCR反应产物于琼脂糖凝胶中进行电泳，EB染色并凝胶成像拍照。HMGCR前片段PCR、HMGCR后片段的PCR琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，表明HMGCR基因前片段和后片段的分子量大小正确，证明扩增成功。

4.3)测序：从大小正确的PCR反应产物中取出20μL送至测序公司(上海生工生物工程有限公司)测序，测序结果如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。测序比对结果如图2所示，利用DNA MAN分析结果表明HMGCR前片段和后片段序列正确，同源性100％，测序结果正确。

S2：构建pSJMY-mCherry重组荧光标签载体：

5)利用引物对mCherry红珊瑚蛋白基因进行PCR扩增；

mCherry红珊瑚蛋白基因的引物对如表6所示：

表6

图3为mCherry红珊瑚荧光蛋白基因PCR结果琼脂糖凝胶电泳图，图中显示条带清晰，基因分子量正确，表明成功得到mCherry红珊瑚荧光蛋白基因。

6)将步骤5)得到的mCherry红珊瑚蛋白基因分别与载体pS100010(该载体购于Origene公司)构建pSJMY-mCherry重组荧光标签载体(构建至载体C末端)，并对载体通过目的基因PCR、限制性酶切鉴定。

6.1)提取质粒：质粒的提取过程与S1中步骤4.1)质粒提取过程相同。

6.2)目的基因PCR：目的基因PCR的扩增体系及条件如下：表6为配制的反应液。

表6

PCR反应条件设置如下：

步骤1.95℃，2min；

步骤2.94℃，30s；

步骤3.56℃，30s；

步骤4.72℃，40s；

步骤5.Go to 2,30cycles；

步骤6.72℃，5min；

步骤7.Hold 4℃，5-10min；

步骤8.End。

PCR反应结束后，取1-3μL PCR反应产物于琼脂糖凝胶中进行电泳实验，EB染色并凝胶成像拍照，结果如图4所示，图中1、3泳道表示pSJMY-mCherry荧光载体，条带清晰，表明pSJMY-mCherry荧光载体已成功构建。

6.3)限制性酶切过程：根据表7建立酶切反应体系，将配制好的酶切混合物与37℃水浴1-2h。结束后直接进行琼脂糖凝胶电泳实验，采用EB进行染色并凝胶成像拍照。

表7

载体双酶切结果如图4中2、4泳道所示，由图中可以看出，双酶切结果能清晰看到荧光基因片段，且载体和基因片段大小均正确。

S3：将步骤S1得到的HMGCR基因与步骤S2得到的重组荧光标签载体结合，构建重组表达载体pSJMY-H-mCherry：

7)选取步骤4)得到的前、后片段测序均正确的转化子进行重新组合，将前后片段分别从T载体上切胶回收，与步骤6)得到C端含有mCherry红色珊瑚蛋白荧光的空载体pSJMY-mCherry连接得到pSJMY-H-mCherry，并将连接产物转化大肠杆菌，得到转化子：

7.1)目的基因HMGCR的酶切

酶切体系如表8所示，将配制好的酶切混合物于37℃水浴1～2h。

表8

7.2)切胶回收纯化HMGCR片段：

胶回收过程按照Omega胶回收试剂盒的说明书进行。

7.21)酶切反应结束后直接进行琼脂糖凝胶电泳跑胶，当含有HMGCR片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯下将目的DNA片段切下(如图5A所示)，并尽量去除多余的凝胶。

7.22)将步骤7.21)得到的带有目的基因的凝胶块转移至1.5mL离心管中，称重得出凝胶块的重量。近似确定其体积(假设其密度为1g/mL)，计算出体积为0.2mL；加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，将混合物置于55℃～65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，期间每隔2～-3min震荡混合物混匀一次；需要注意的是，在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding Buffer混合物的pH值。如果其pH值大于8，则DNA的产量将大大减少。观察混合物的颜色，如果是橙色或红色，则需要加入5μL浓度为5M、pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。

7.23)转移步骤7.22)得到的DNA-琼脂糖溶液700μL到一个HiBind DNA柱子中并把柱子装在一个干净的2mL收集管内。室温下10,000×g离心1min，弃去滤出液。其中一个HiBind DNA柱子最多可容纳700μL的溶液，若DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μL，可先转移700μL溶液，离心完后，将余下的溶液继续加到柱子上。但是每一个HiBind DNA柱子至多可以结合25～-30μg DNA。如果预期产量较大，则需要把样品分别加到合适数目的柱子中。

7.24)将柱子重新套回收集管中，加入700μL SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下10,000×g离心1min，弃去滤出液。其中SPW Wash buffer在使用前需按照瓶子标签要求用无水乙醇进行稀释。

7.25)将柱子重新套回收集管中，重复7.24)步骤两次。

7.26)将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min用以甩干柱基质残余的液体。此步骤对得到DNA高产量至关重要。

7.27)将柱子装在一个干净的1.5mL离心管中，加入30～50μL洗脱液或灭菌水到柱子膜上，室温10,000×g离心1min，离心管中的溶液即纯化的DNA产物-HMGCR回收片段，使用前于-20℃保存。

7.3)纯化的线性化载体pSJMY-mCherry的制备：

7.31)双酶切空载体pSJMY-mCherry得到线性化载体

酶切体系及酶切过程参照7.1)，将质粒更换为pSJMY-mCherry。

7.32)切胶回收纯化

为了降低非线性化载体带来的影响，酶切结束后直接进行跑胶回收线性化载体，步骤同7.1)，如图5B所示空载体酶切回收片段即纯化的线性化pSJMY-mCherry载体。

7.4)连接：

切胶回收之后，将纯化的HMGCR回收片段和空载体pSJMY-mCherry酶切回收片段使用T4连接酶于22℃连接20-24h得到pSJMY-H-mCherry。连接体系如表9所示，其中连接酶购于ThermoFisher公司，HMGCR片段与空载体的摩尔比为3:1～10:1：

表9

7.5)转化：

转化大肠杆菌过程同步骤3)，得到含重组表达载体pSJMY-H-mCherry的转化子。

8)以HMGCR前片段的正向引物和HMGCR后片段的反向引物对步骤7)得到的转化子进行菌落PCR扩增，用以筛选阳性克隆：

对步骤7)的转化子采用菌落PCR法筛选阳性克隆，挑取单菌落进行菌落PCR验证，PCR扩增体系反应液如表10-1、表10-2所示。

表10-1

PCR反应条件设置如下：

步骤1.95℃，2min；

步骤2.94℃，30s；

步骤3.56℃，30s；

步骤4.72℃，40s；

步骤5.Go to 2,30cycles；

步骤6.72℃，5min；

步骤7.Hold 4℃，5-10min；

步骤8.End。

PCR反应结束后，取1-3μL PCR反应产物于琼脂糖凝胶中进行电泳实验，EB染色并凝胶成像拍照。结果如图6A，图中可视1-10号转化子中7-9号转化子可以扩增出mcherry基因。进一步以5-9号转化子为模板扩增HMGCR基因，进一步确认7-9转化子。

表10-2

PCR反应条件设置如下：

步骤1.95℃，2min；

步骤2.94℃，30s；

步骤3.56℃，30s；

步骤4.72℃，3min；

步骤5.Go to 2,30cycles；

步骤6.72℃，5min；

步骤7.Hold 4℃，5-10min；

步骤8.End。

PCR反应结束后，取1-3μL PCR反应产物于琼脂糖凝胶中电泳，EB染色并凝胶成像拍照。结果如图6B所示，pSJMY-H-mCherry转化子单克隆菌落的PCR结果琼脂糖凝胶电泳图显示7～9泳道条带清晰，由前片段的正向引物和后片段的反向引物作为一对引物可以扩增出条带，该条带大小和位置均正确，证明HMGCR全长片段已成功得到，即对应的转化子菌落为阳性克隆。

9)将经过步骤8)确认阳性克隆的菌落扩大培养，即将阳性克隆的菌落接种于含Amp的LB抗性液体培养基中，于37℃空气摇床中180～200rpm培养过夜。提取质粒，并通过限制性酶切的方式对重组表达载体pSJMY-H-mCherry进行鉴定。

酶切体系如表11所示，配制好后将酶切混合物置于37℃水浴1～2h。

表11

酶切结束后将产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，图7显示酶切结果载体单切(内切酶SgfI或者XhoI)、融合蛋白总基因片段的双酶切(内切酶SgfI-PmeI)、HMGCR基因片段的双酶切(内切酶SgfI-MluI)大小均正确。菌落PCR和重组表达载体的限制性酶切结果均验证了本发明重组表达载体pSJMY-H-mCherry成功构建。

S4：将步骤S3得到的重组表达载体pSJMY-H-mCherry转染细胞，然后将转染细胞中表达的HMGCR蛋白抗原与待测血清进行免疫反应，用于检测待测血清中是否存在抗HMGCR抗体：

10)将HEK293 T细胞接种至24孔培养板及腔室载玻片系统中，24h后细胞达80％浓度时，分别将步骤9)得到的pSJMY-H-mCherry载体与转染试剂(Turbo 8.0)按照质量体积比0.1μg：0.3μL转入HEK293T细胞进行转染。放至CO

11)首先将除去步骤10)转染的HEK293T细胞培养基中的上清液，用PBS清洗转染细胞，弃去洗涤液PBS，然后用多聚甲醛固定细胞20min，再用PBS清洗2遍。然后加入含Triton试剂(品牌：Sigma)、BSA试剂(品牌：GENVIEW)进行破膜及封闭3小时至过夜得到通透的含重组表达载体pSJMY-GFP

对瞬时转染的细胞进行鉴定和评估：从转染细胞中提取全蛋白进行蛋白免疫实验，对上述含重组表达载体的细胞进行HMGCR蛋白表达水平验证：

11.1)总蛋白提取：

(1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走；

(2)每瓶细胞加3mL 4℃预冷的PBS(0.01M pH 7.2～7.3)，平放培养瓶，轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液，PBS完全除去后将培养瓶置于冰上；

(3)按裂解液：PMSF(100mM)比例为1mL：10μL的比例向步骤(2)的培养瓶中添加，其中PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合，摇匀后将培养瓶置于冰上；

(4)向步骤(3)中得到的培养瓶汇总添加裂解液，每瓶细胞加100～400μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动；

(5)裂解完后，快速用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中，尽可能保证整个操作在冰上进行；

(6)将步骤(5)的离心管于4℃下12000rpm离心5min。

(7)将步骤(6)得到的离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃或者-70℃保存备用。

11.2)制备电泳凝胶SDS-PAGE及蛋白电泳

(1)清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干；

(2)灌胶与上样：将步骤(1)清洗过后的玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡在架子上卡紧，准备上胶；灌胶时，可用1mL枪吸取1mL胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。其中浓缩胶的使用方法为：4％浓缩胶配合10％的分离胶使用。然后在胶上加一层水，液封后的胶凝得更快，室温放置0.5～1h至聚合完全。当水和胶之间有一条折射线时，表明已凝胶。间歇3min使胶充分凝固后，倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，为避免胶中有气泡产生，灌胶时使胶沿玻璃板流下，插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中需要补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两端竖直向上轻轻将其拔出。凝胶聚合约0.5～1小时左右。

浓缩胶经水冲洗后放入电泳槽中，去提取好的蛋白，约10～15μL与5×SDS上样缓冲液按5:1的比例混合，加到1.5mL离心管中，然后在沸水中煮3～5min使蛋白完全变性。电泳的过程为首先设置电压为80V，当样品到达浓缩胶与分离胶交界处时调高电压至120～150V，当溴酚蓝迁移至胶底处即可终止电泳，然后进行转膜。

11.3)转膜

首先制备足够量的转转移缓冲液充满移动槽，另准备200mL转移缓冲液用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗15～30min；将滤纸在转移缓冲液中浸泡30s；取PVDF膜在甲醇中润湿15s，保证膜变成半透明状，再将PVDF膜放入双蒸水中浸泡2min，接着将PVDF膜放入转移缓冲液中平衡5min。

将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒反复挤压排除里面的气泡。剥胶之前首先将玻璃板去除，将浓缩胶轻轻刮去，避免将分离胶刮破，同时做好标记。小心地将分离胶覆盖在滤纸上，同样地用玻璃棒挤压排出气泡。然后将PVCF膜覆盖于分离胶上，排除气泡。然后在PVDF膜上覆盖三张滤纸，并排除气泡。最后覆盖海绵垫，排除气泡后合上夹子。整个操作过程在转移液中进行，并需要不断排除气泡。将夹子放入转移槽中，并使夹子的黑面正对转移槽的黑面，夹子的红面正对转移槽的红面。转膜装置置于冰上，以200mA进行2h。

11.4)封闭

将步骤11.3)得到的膜移至含有封闭液的平皿中，室温下用封闭液在脱色摇床上摇动封闭2h或者4度过夜。

11.5)一抗

将一抗(品牌：Santacuz/Affinity)用封闭液稀释备注为1:4000至1:8000之间，从步骤11.4)得到的封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝上放于抗体液面上，脱色摇床上37℃孵育1～2h或者过夜。

11.6)洗涤

用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min，如果预实验发现背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；如果预实验发现条带较淡，可以一抗4℃过夜孵育。

11.7)二抗

将二抗稀释液与膜接触，37℃孵育2h。其中二抗品牌：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，稀释液品牌：上海闪晶分子生物科技有限公司。11.8)洗涤

将步骤11.7)得到的膜用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min；如果预实验发现背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；如果预实验发现条带较淡，可以二抗4℃过夜孵育。

11.9)曝光及拍照

按照试剂盒说明书将A液与B液(ECL超灵敏发光检测试剂盒购于EpiZyme雅酶公司)在离心管中等体积混合，1min后将溶液平铺在膜蛋白上，暗室反应2min后除去残液，包好放入X-光片夹中。将胶片进行扫描或拍照，采用凝胶图像处理系统并分析条带。

结果如图8所述，图片表明HMGCR蛋白在细胞中成功表达。

12)向步骤11)得到的细胞中表达的HMGCR蛋白的细胞培养板(NEST)板孔中添加待测血清(血清标本数150例)进行免疫反应：

12.1)取临床免疫性坏死性肌病疑似病例患者的血清作为标本，并进行比例稀释：

12.2)弃去转染细胞表面封闭液，加入12.10步骤中的稀释血清样本，得到混合均匀的混合液并于37℃下孵育30min-2h；

12.3)向步骤12.2)得到孵育完成的混合液中加入含triton(品牌：Sigma)的PBS洗涤液洗涤，然后向重组表达载体pSJMY-H-mcherry的细胞对应加入抗人的Alexa

12.4).加入一定体积的磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察。

使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照，并记录两类不同荧光标签载体的激发光观察顺序。本发明利用双色间接免疫荧光法测定人血清中的抗HMGCR抗体情况。如图9所示，重组表达载体pSJMY-H-mcherry转染到对应的HEK293T细胞中表达红色荧光蛋白和HMGCR蛋白的融合蛋白，加入血清后发生免疫反应，如果CBA的荧光分别呈现出红色和绿色荧光。图9A所示为红色荧光可以指示载体转染效果以及对应融合蛋白表达位置，绿色荧光结果呈现有红色细胞形态，同时红色荧光细胞形态和绿色荧光细胞形态位置一致可以融合，呈现黄色荧光效果，表明该血清样本中含有抗HMGCR抗体，证明血清中有HMGCR抗体，即待测血清为阳性标本；作为对照，图9B显示为CBA的荧光只呈现出红色荧光但无绿色荧光效果，红色荧光指示载体转染效果以及对应融合蛋白表达位置，绿色荧光结果没有明显的细胞形态，融合后也未呈现黄色荧光效果，表明该血清样本中无抗HMGCR抗体，即待测血清为阴性标本。通过本发明提供的方法可以检测疑似病例患者血清中是否含有抗HMGCR抗体，从而诊断是否患有免疫性坏死性疾病，辅助临床最终诊断。

综上，本发明构建的重组表达荧光载体用于双色间接免疫荧光法检测人体内抗HMGCR抗体具有较高的灵敏性，对患者的早期诊断和疗效评价均有明确的指导意义，具有显著的社会效益和巨大的经济效益。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

郑州大学

一种检测免疫性坏死性肌病血清抗HMGCR抗体的方法

说明书

8

SIPOSequenceListing 1.0

1

33

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

1

ggggcgatcg ccatgttgtc aagacttttt cga 33

2

57

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

2

tttgctgagg tagtaggttg gtccaccacc caccgttcct atctctatag atggcat 57

3

25

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

3

tttcctcagc aagcctgttt gcaga 25

4

25

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

4

aaaacgcgtg gctgtcttct tggtg 25

5

35

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

5

tacgcggccg ctcgagatgg tgagcaaggg cgagg 35

6

43

DNA

人工序列(Artificial Sequence)

6

cgcggccggc cgtttaaacc tacttgtaca gctcgtccat gcc 43

7

2452

DNA

HMGCR qian

7

gcgatcgcca tgttgtcaag actttttcga atgcatggcc tctttgtggc ctcccatccc 60

tgggaagtca tagtggggac agtgacactg accatctgca tgatgtccat gaacatgttt 120

actggtaaca ataagatctg tggttggaat tatgaatgtc caaagtttga agaggatgtt 180

ttgagcagtg acattataat tctgacaata acacgatgca tagccatcct gtatatttac 240

ttccagttcc agaatttacg tcaacttgga tcaaaatata ttttgggtat tgctggcctt 300

ttcacaattt tctcaagttt tgtattcagt acagttgtca ttcacttctt agacaaagaa 360

ttgacaggct tgaatgaagc tttgcccttt ttcctacttt tgattgacct ttccagagca 420

agcacattag caaagtttgc cctcagttcc aactcacagg atgaagtaag ggaaaatatt 480

gctcgtggaa tggcaatttt aggtcctacg tttaccctcg atgctcttgt tgaatgtctt 540

gtgattggag ttggtaccat gtcaggggta cgtcagcttg aaattatgtg ctgctttggc 600

tgcatgtcag ttcttgccaa ctacttcgtg ttcatgactt tcttcccagc ttgtgtgtcc 660

ttggtattag agctttctcg ggaaagccgc gagggtcgtc caatttggca gctcagccat 720

tttgcccgag ttttagaaga agaagaaaat aagccgaatc ctgtaactca gagggtcaag 780

atgattatgt ctctaggctt ggttcttgtt catgctcaca gtcgctggat agctgatcct 840

tctcctcaaa acagtacagc agatacttct aaggtttcat taggactgga tgaaaatgtg 900

tccaagagaa ttgaaccaag tgtttccctc tggcagtttt atctctctaa aatgatcagc 960

atggatattg aacaagttat taccctaagt ttagctctcc ttctggctgt caagtacatc 1020

ttctttgaac aaacagagac agaatctaca ctctcattaa aaaaccctat cacatctcct 1080

gtagtgacac aaaagaaagt cccagacaat tgttgtagac gtgaacctat gctggtcaga 1140

aataaccaga aatgtgattc agtagaggaa gagacaggga taaaccgaga aagaaaagtt 1200

gaggttataa aacccttagt ggctgaaaca gataccccaa acagagctac atttgtggtt 1260

ggtaactcct ccttactcga tacttcatca gtactggtga cacaggaacc tgaaattgaa 1320

cttcccaggg aacctcggcc taatgaagaa tgtctacaga tacttgggaa tgcagagaaa 1380

ggtgcaaaat tccttagtga tgctgagatc atccagttag tcaatgctaa gcatatccca 1440

gcctacaagt tggaaactct gatggaaact catgagcgtg gtgtatctat tcgccgacag 1500

ttactttcca agaagctttc agaaccttct tctctccagt acctacctta cagggattat 1560

aattactcct tggtgatggg agcttgttgt gagaatgtta ttggatatat gcccatccct 1620

gttggagtgg caggacccct ttgcttagat gaaaaagaat ttcaggttcc aatggcaaca 1680

acagaaggtt gtcttgtggc cagcaccaat agaggctgca gagcaatagg tcttggtgga 1740

ggtgccagca gccgagtcct tgcagatggg atgactcgtg gcccagttgt gcgtcttcca 1800

cgtgcttgtg actctgcaga agtgaaagcc tggctcgaaa catctgaagg gttcgcagtg 1860

ataaaggagg catttgacag cactagcaga tttgcacgtc tacagaaact tcatacaagt 1920

atagctggac gcaaccttta tatccgtttc cagtccaggt caggggatgc catggggatg 1980

aacatgattt caaagggtac agagaaagca ctttcaaaac ttcacgagta tttccctgaa 2040

atgcagattc tagccgttag tggtaactat tgtactgaca agaaacctgc tgctataaat 2100

tggatagagg gaagaggaaa atctgttgtt tgtgaagctg tcattccagc caaggttgtc 2160

agagaagtat taaagactac cacagaggct atgattgagg tcaacattaa caagaattta 2220

gtgggctctg ccatggctgg gagcatagga ggctacaacg cccatgcagc aaacattgtc 2280

accgccatct acattgcctg tggacaggat gcagcacaga atgttggtag ttcaaactgt 2340

attactttaa tggaagcaag tggtcccaca aatgaagatt tatatatcag ctgcaccatg 2400

ccatctatag agataggaac ggtgggtggt gggaccaacc tactacctca gc 2452

8

234

DNA

HMGCR hou

8

cctcagcaag cctgtttgca gatgctaggt gttcaaggag catgcaaaga taatcctggg 60

gaaaatgccc ggcagcttgc ccgaattgtg tgtgggaccg taatggctgg ggaattgtca 120

cttatggcag cattggcagc aggacatctt gtcaaaagtc acatgattca caacaggtcg 180

aagatcaatt tacaagacct ccaaggagct tgcaccaaga agacagccac gcgt 234