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摘要：

天然免疫系统是人体抵抗外来病原微生物感染的第一道防线,在病毒感染过程中,模式识别受体通过识别病毒中的病原相关分子模式启动抗病毒天然免疫反应及程序性的细胞死亡从而限制,抵抗病毒的感染.泛素化修饰是机体关键的蛋白质翻译后修饰方式之一,它发生在细胞活动的各个阶段,在免疫应答过程中也发挥着非常重要的作用,作为泛素化修饰过程中的关键分子,E3泛素连接酶在抗病毒天然免疫反应过程中的新功能,新调控方式的研究一直是免疫学研究的热点问题.因此,本实验室对病原微生物刺激后的小鼠原代腹腔巨噬细胞及单核巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞进行了E3泛素连接酶表达谱芯片的分析,从该芯片结果中,我们关注到了一群以往在天然免疫中功能鲜有报道的E3泛素连接酶家族SCF复合体(SKP1-CUL1-F-BOX protein complex),该复合体的标志性蛋白为发挥底物蛋白识别功能的F-BOX蛋白,我们分析了芯片结果中F-BOX蛋白的表达量及反应性并选择了8个功能未知的FBXO蛋白筛选了它们在抗病毒天然免疫中的功能,从中确定了SCFFBXO21作为我们进一步研究的对象. 在本研究中我们发现了FBXO21在抗病毒天然免疫及病毒诱导的细胞死亡中发挥着重要的作用.在小鼠原代巨噬细胞及RAW264.7细胞中,干扰FBXO21可以明显抑制VSV病毒及HSV病毒所刺激的IL-6,IFN-β的产生.利用免疫共沉淀,质谱分析技术以及Western blot实验发现了FBXO21可以与ASK1相互结合并且对其进行K29多聚泛素化修饰.ASK1是TLR信号及凋亡信号中的关键调控分子,但是它在抗病毒天然免疫中的功能以及修饰方式还不明确.因此我们对ASK1在抗病毒天然免疫中的修饰和功能做了深入分析. 利用CRISPER/CAS9基因编辑系统构建FBXO21表达缺陷的RAW264.7细胞后,用VSV,HSV刺激细胞,FBXO21-/-RAW264.7细胞中ASK1的K29多聚泛素化水平明显低于对照组,下游的JNK,P38,TBK1,IRF3的磷酸化水平以及IL-6,IFN-β的表达也明显的降低,但病毒在其中的复制却明显的增强.另一方面,在VSV,HSV刺激细胞后,FBXO21表达缺陷的细胞的死亡也明显的弱于对照组.利用ASK1激酶活性缺失以及泛素化位点突变的载体进行实验后发现,FBXO21对ASK1进行的泛素化修饰可以促进其激酶活性从而活化下游抗病毒及细胞死亡信号.信号通路抑制剂的研究发现JNK1/2是FBXO21-ASK1下游活化的关键信号通路.通过以上的研究,我们得出了以下结论:FBXO21可以通过对ASK1进行K29多聚泛素化修饰从而活化其功能,进一步促进抗病毒天然免疫反应过程中IL-6,IFN-β的表达及细胞的死亡.该研究不仅发现了FBXO21在抗病毒天然免疫反应中的新功能,也创新性的提出了K29泛素化修饰对ASK1的活化作用,这也为泛素化修饰调控激酶活性提供了新的参考.

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关键词：

抗病毒天然免疫 泛素化修饰 SCF复合体 基因功能

年份：

2017