在做功能基因组学研究时，经常会用到多序列比对，其主要用于描述一组序列之间的相似性关系，以便对一个基因家族的特征有一个简明扼要的了解。

前几期小编推送的两个分子生物学软件都可以用于多序列比对，包括SnapGene和DNAMAN。

但要说到最强大的多序列比对软件，MEGA肯定是其中之一。因此本期小编就给大家简单介绍MEGA的用法，并对这三款软件的多序列比对功能做一个小结。

https://www.megasoftware.net/

MEGA的全称为Molecular Evolutionary Genetics Analysis，也就是专门用于分子进化遗传分析的一款软件。

软件是完全免费的，目前已更新到MEGA10，在官网就能直接下载安装。

下载时注意选择软件版本，包括Window/Mac/Linux三种，并根据电脑选择32/64位版本下载安装。网站也提供了详细的说明文档，在右上角菜单→【tutorial】→【walk through】目录下，有关于MEGA的详细操作说明。

MEGA10的界面如下，从工具栏我们也可以看到其强大的功能，如序列比对、进化分析、选择分析等等。

2.1 用NCBI进行BLAST

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

MEGA支持的序列格式为FASTA，一般需要我们自己准备序列文件。通常做进化分析时我们会在NCBI中进行BLAST（对NCBI不熟悉的读者请参考小编之前的推送NCBI网站的小彩蛋），搜索目的序列在数据库中的同源序列。

这里以水稻的绿色革命基因SD1为例，先查询其蛋白序列，粘贴到NCBI-BLAST网站相应位置，选择数据库和物种后，点击BLAST按钮。

这里顺便回顾一下BLAST的几个注意事项：

(1) 考虑到密码子的简并性，BLAST通常优先用蛋白序列比对，没有蛋白序列的情况下再考虑用核酸序列比对，这样能最大限度减少假阳性；

(2) 在比对时应该注意合理选择数据库和物种信息，比如核酸序列比对时通常选择Nucleotide collection数据库，如果是人类或者小鼠的序列比对则直接选择相应物种的数据库，而蛋白序列比对时通常选择swisspot数据库；

(3) 关于算法参数，一般用默认参数即可，但某些特定情况下需要修改参数，比如你需要比对的序列在生物中非常少见，默认的参数可能没有结果，这时候可将期望阈值（Expect threshold）调整为100或者1000，可能会得到较多的比对结果。

2.2 序列下载

BLAST的结果中其实有很多内容，不仅包括具体的序列信息，还包括序列比对的图形展示和进化树。这里先不做进一步介绍，下载序列的方式如下图所示，选择FASTA (complete sequence) 。

2.3 序列比对

打开MEGA，单击工具栏【ALIGN】→【File】→【Edit/Build Alignment】→【Creat a new Alignment】→【Protein】，在Alignment Explorer窗口直接将上述下载的序列粘贴进来。（注意下图中的序列全是红色表示都选中了，如果没有选中序列可以按【Ctrl+A】）

单击菜单【Alignment】→【Alignment by ClustalW】，调整参数（一般用默认参数即可）后点击【OK】，即可完成序列比对。

最后单击菜单【Data】→【Save Session】→【MEGA Format】，保存序列比对的结果。

前面提到DNAMAN、SnapGene和MEGA都能做序列比对，各自有其优劣，小编自己总结了3款软件的优势和使用习惯，希望能对读者有所帮助。

（1）DNAMAN的优势在于序列比对的结果图形化显示清晰，可直接用于文章图片中；

（2）SnapGene的优势在于双链显示序列，而且可结合测序图显示，用于测序文件和参考序列的比对时非常方便；

（3）MEGA的优势在于进化分析，可用于成千上万条序列的比对，并且有相应的Linux版本，在大样本的分析中有重要的应用。

往期文章：

投必得论文编译：SnapGene教程—常用生物学软件的安装与应用（一）

投必得论文编译：常用生物学软件的安装与应用（二） —DNAMAN

投必得论文编译：常用生物学软件的安装与应用（三）—Primer6

投必得论文编译：NCBI网站的小彩蛋

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