Q1：如何评判RNA质量

A1：RNA质量从两个方面进行检测：

⑴ RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行逆转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA 已完全降解，需要重新提取

⑵ RNA的纯度。RNA的纯度可以通过测定OD260/280和OD260/230两个比值，在1.8-2.1范围内表示纯度较高。

注：建议使用1%的琼脂糖凝胶，210V电泳10-12min；加好loading后的RNA可以放置在PCR仪上70℃，2min，使RNA变性后再进行电泳，这样跑出来的RNA条带更好看，也更能反应RNA的完整性；

Q2：如何选择逆转录的引物

A2：逆转录三种引物：

⑴ 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。

⑵ Oligo dT：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。 由于Oligo dT结合在PolyA尾上，所以对 RNA 样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

⑶ 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因逆转录。

引物选择依据: cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端的扩增偏好性。

Q3：对于逆转录加样的操作注意事项

A3：⑴ 4 × gDNA wiper Mix、5 × HiScript III qRT SμperMix及5 × No RT Control Mix含有高浓度的甘油，在使用前请短暂离心收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打充分混匀后准确吸取。

⑵ 20 µl逆转录反应体系建议加入不超过1 µg的Total RNA。如果目的基因表达量非常低，最多加入5 µg total RNA，否则加入RNA量过高， 可能会超出后续定量PCR的线性范围。

⑶ 可以不进行基因组去除步骤，直接用逆转录试剂进行逆转录，但是请勿将4 × gDNA wiper Mix与不含基因组去除模块的试剂配套使用（如与R222配套使用），因为不含基因组去除模块的试剂盒中的Mix不含终止gDNA wiper反应的成分，有可能会影响cDNA稳定性。

Q4：可以通过检测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗？

A4：不可以，逆转录产物cDNA是混合物，除了cDNA产物以外，还有bμffer、逆转录酶、引物，同时还包含未转录的模板RNA，总RNA中的tRNA、rRNA等，都会干扰浓度测定结果，因此不能反应真实的cDNA产量；cDNA同样不可以纯化，因为逆转得到的cDNA长短不一，纯化会损失短的cDNA。

Q5：cDNA模板需要稀释吗？应该稀释多少倍进行定量？

A5：没有具体的稀释参考倍数，一般cDNA每稀释10倍CT值变大3.3，可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用cDNA原液、10倍稀释液、100倍稀释液作为模板进行定量实验，根据规律选择CT值落在18-28范围内的稀释倍数。也可以参考换试剂之前的稀释倍数。

注：当使用 cDNA 原液进行检测的时候，使用量不能超过qPCR 反应体系的 1/10，因为 cDNA 中包含很多抑制 qPCR 的组分，cDNA 体积大时风险很高。

Q6：逆转录试剂盒可以用于lncRNA和cirRNA吗？

A6：可以，和普通的RNA逆转类似。不过lncRNA比较长，建议在去除基因组步骤前先进性65℃ 5min预变性，打开二级结构再进行逆转录。并不是所有的LncRNA都包含PolyA 尾，所以如果使用逆转录试剂盒，可以同时添加随机引物与OligodT两种引物，或者只添加随机引物一种引物，但不能只添加Oligo dT一种引物。

cirRNA为环状闭合结构，没有poly A尾，逆转录时只加随机引物。cirRNA长度跨度较大，比较长的话建议跟lncRNA一样先预变形，正常的话就按照正常程序就行了。

关于引物的选择，总的来讲：

mRNA可以选用随机引物+OligodT；随机引物；OligodT；GSP（基因特异性引物）；

cirRNA可以选用随机引物；GSP（基因特异性引物）；

LncRNA可以选用随机引物+OligodT；随机引物；GSP（基因特异性引物）；LncRNA在进行逆转录之前需要进行RNA预变性。

Q7：与二代逆转录产品相比，三代逆转录产品的优势是什么？

A7：（1）与二代产品相比，三代酶CT值偏小1-2 Cycles;

       （2）三代产品对于降解的RNA逆转录效率高，可逆转Rin=2.5的RNA；

       （3）在高RNA模板（1-5 μg）投入的情况下，依然具有很高的逆转录效率；

       （4）对乙醇、异丙醇、酚、异硫氰酸胍（RNA提取中引入的杂质）等常见杂质耐受度极高。