目录

实时 PCR，也称为定量 PCR (qPCR)，是一种分子生物学技术，可在扩增过程中实时扩增、检测和定量 DNA 或 RNA。 它使用荧光染料或探针来测量荧光强度的增加，从而提供有关样品中存在的目标核酸数量的定量数据。

实时 PCR 的原理，也称为定量 PCR (qPCR)，是一种用于实时扩增和定量特定 DNA 或 RNA 序列的强大技术。 它建立在逆转录 PCR (RT-PCR) 和传统 PCR 的原理之上。

在实时 PCR 中，该过程首先使用称为逆转录酶的酶将 RNA 样本转化为互补 DNA (cDNA)。 此步骤称为逆转录。 逆转录酶以 RNA 模板为向导合成一条互补的 DNA 链。 结果，RNA 被转化为双链 cDNA。

获得 cDNA 后，可以使用 PCR 原理进一步扩增和定量。 加热 cDNA 使双链 DNA 变性或分离成两个单链 DNA 模板。 这些模板包含与特定引物互补的区域。

引物是短的 DNA 序列，旨在结合感兴趣的 DNA 序列中的特定目标区域。 这些引物是根据核酸杂交原理设计的，其中互补序列将退火或相互结合。

在实时 PCR 的退火步骤中，温度降低，使引物能够特异性结合单链 DNA 模板上的互补序列。 此步骤确保引物靶向所需的 DNA 序列，该序列将被扩增。

退火后，温度升高，DNA 聚合酶（一种负责 DNA复制，通过在每个引物的 3' 末端添加核苷酸来延伸引物。 此步骤称为延伸，它会导致使用原始 DNA 模板合成互补 DNA 链。

变性、退火和延伸这三个步骤在专门的热循环仪中以循环方式重复多次。 这台机器控制和调节每个步骤所需的温度变化。 通过循环经历这些温度变化，产生了数百万个 cDNA 拷贝。

在扩增过程中，real-time PCR仪还对扩增的DNA量进行实时检测和定量。 这是通过在 PCR 反应中加入荧光染料或探针来实现的。 随着 DNA 的合成，染料与新合成的 DNA 链结合并发出荧光。 在每个循环中测量荧光信号，从而对感兴趣的 DNA 或 RNA 进行定量。

与传统 PCR 方法相比，实时 PCR 具有多项优势。 它可以实时检测和量化特定的 DNA 或 RNA 序列，而无需进行扩增后分析。 这使其成为各种应用中的宝贵工具，包括基因表达分析、病原体检测和基因检测。

综上所述，real-time PCR 的原理是结合逆转录和 PCR 技术，对特定的 DNA 或 RNA 序列进行扩增和定量。 通过利用核酸杂交和 DNA 复制的原理，实时 PCR 允许实时扩增和测量目标序列，为各种生物过程提供有价值的见解。

RT-PCR，或逆转录 PCR，需要几个 酶 和其他成分，以促进 RNA 转化为 cDNA 以及随后的扩增。 RT-PCR 的关键要求包括：

总之，RT-PCR 需要逆转录酶和 DNA 聚合酶等酶，以及特异性引物、dNTP、缓冲液和热循环仪。 这些成分共同作用将 RNA 转化为 cDNA 并扩增目标序列，从而能够检测和定量样品中的特定 RNA 分子。

它是一种有价值的工具，用于通过估计某些 RNA 的丰度来评估基因表达。 有两种方法可用于实时 PCR，例如： 一步式 RT-qPCR 和两步式 RT-qPCR。

在这两种方法中，都有一个共同的步骤，即首先将 RNA 逆转录成 cDNA，然后将该 cDNA 用作 qPCR 扩增的模板。 

在一步式 RT-qPCR 中，cDNA 合成和 qPCR 是在一个反应​​容器中的普通反应缓冲液中进行的。 而在两步法 RT-qPCR 中，cDNA 在一个反应​​中合成，然后将等份的 cDNA 用于后续的 qPCR 实验。

一步式 RT-qPCR 是一种分子生物学技术，将逆转录 (RT) 和定量聚合酶链反应 (qPCR) 过程结合在一个反应​​中。 它具有多种优势，常用于基因表达分析、病毒检测和其他需要 RNA 定量的应用。 以下是一步法 RT-qPCR 的要点：

One-Step RT-qPCR 为基因表达分析和 RNA 定量提供了一种简化且高效的方法。 通过在单个反应中结合逆转录和 qPCR，它简化了实验工作流程并降低了实验变异性的风险。 当处理大量样品或重复扩增有限数量的已知目标时，它特别有利。 基因特异性引物的使用和更高 RT 反应温度的潜力有助于提高单步 RT-qPCR 检测的特异性、准确性和效率。

一步式 RT-qPCR，也称为一步式逆转录定量 PCR，与其他 PCR 方法相比具有多项优势。 一步法 RT-qPCR 的一些主要优点是：

总之，一步式 RT-qPCR 具有以下优势，例如设置简单、准确性和特异性更高、污染机会减少、成本和时间节省、数据重现性提高、适用于高通量应用、最少的样品处理以及快速和高度可重现的结果。 这些优势使一步法 RT-qPCR 成为各种分子生物学和诊断应用中的宝贵工具。

一步法 RT-qPCR 尽管有其优点，但也有一些应该考虑的缺点。 这些缺点包括：

在为特定实验决定合适的 PCR 方法时，考虑这些缺点很重要。 虽然一步式 RT-qPCR 在简单性和速度方面具有优势，但应仔细评估其局限性以确保实现预期结果。

执行一步式 RT-qPCR 的标准方案包括以下步骤：

两步法 RT-qPCR 是一种广泛使用的分子生物学技术，涉及两个独立的步骤：逆转录 (RT) 和定量聚合酶链反应 (qPCR)。 这种方法在某些实验场景中提供了灵活性和优势。 以下是两步法 RT-qPCR 的要点：

两步法 RT-qPCR 为基因表达分析和转录本定量提供了多功能性和便利性。 通过分离逆转录和 qPCR 步骤，研究人员可以更灵活地处理珍贵样品、检查多个目标和表征新目标。 在 RT 步骤中生成的 cDNA 可以存储并用于后续的 qPCR 实验或同一样本的基因表达定量。

两步法 RT-qPCR 是一种广泛使用的分子生物学技术，在基因表达分析和转录本定量方面具有多项优势。 以下是两步法 RT-qPCR 的主要优势：

总体而言，两步法 RT-qPCR 在灵活性、效率、准确性和可靠性方面具有优势。 存储 cDNA 以备将来使用的能力、减少反应失败和非特异性结合的可能性以及酶选择的灵活性使其成为各种研究应用中基因表达分析和转录本定量的首选方法。

两步 RT-qPCR 在提供优点的同时，也有一些应该考虑的缺点。 以下是两步法 RT-qPCR 的主要缺点：

在决定合适的 RT-qPCR 协​​议时，考虑这些缺点并评估特定的实验要求和限制非常重要。 虽然两步 RT-qPCR 有其缺点，但由于它适用于某些应用并且能够存储 cDNA 以供进一步分析，因此它仍然是一种广泛使用的方法。

所需试剂

将 RNase 抑制剂和逆转录酶直接从盒子中取出放在 ICE 上。 将 10 倍反应缓冲液、随机十聚体和 dNTP 混合液在手中快速解冻并置于冰上；

程序

阴性对照

在 PCR 中使用两个阴性对照。

正控制

预期的 RT-PCR 产物大小：211bp。引物位于由 59bp 内含子分隔的不同外显子上。 如果扩增基因组 DNA，产物大小为 270bp。

试剂：

下表概述了 PCR 所需的组件。 注意：不要使用经过 DEPC 处理的水。

对于 RpS17 控制： 

制作主混音：

在 Thermacycler 中孵育：

注意：从您的引物设计软件建议的退火温度开始。 约 55°C 的退火温度与显示的循环时间一起使用通常是一个合理的起点，但引物和模板组合的最佳温度和循环时间可能需要根据经验确定。

注意：经验法则是每千碱基目标使用 1 分钟的延伸时间。

在 15-1% 琼脂糖凝胶上运行 1.5 µl 反应

RT-PCR的一般步骤/过程可概括为四个阶段：准备阶段、逆转录、扩增和产物分析阶段。 以下是每个阶段的概述：

这些一般步骤提供了 RT-PCR 程序的概述，可以根据特定的实验要求或一步和两步 RT-PCR 方法的变化对其进行修改。

定量实时逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 实验获得的结果对于了解基因表达水平和比较不同样本至关重要。 两种常用的定量策略是标准曲线法和比较阈值 (Ct) 法。 让我们探索这些方法：

标准曲线方法涉及使用已知浓度的RNA或DNA构建标准曲线。 该曲线可作为定量未知浓度 mRNA 靶标的参考。 虽然可以使用 RNA 标准品，但由于其稳定性和体外转录的需要，它们可能会引入变异性。 或者，其他核酸样品，例如纯化的 质粒 可以使用表达靶基因的DNA或cDNA样品。 这些样品可以使用分光光度测量进行定量并转换为拷贝数值。

重要的是要注意，使用 cDNA 质粒作为标准只会提供有关 mRNA 表达相对变化的信息，因为它们不能控制逆转录步骤效率的变化。 为了解释这一点和 RNA 输入的可变性，建议对管家基因进行标准化。

比较 Ct 方法，也称为 2–ΔΔCt 方法，将感兴趣样品的 Ct 值与对照或校准品进行比较。 校准品和样品的 Ct 值都标准化为内源管家基因，用作内部对照。

为了计算 ΔΔCt，从目标基因和参考基因的校准器的 Ct 值中减去样品的 Ct 值。 公式是：

ΔΔCt = ΔCt_样本 – ΔCt_参考

如果目的基因和参考基因的扩增效率大致相等，则ΔΔCt计算有效。 这可以通过检查 ΔCt 如何随模板稀释而变化来确定。 如果 cDNA 稀释度与 ΔCt 的关系图接近于零，则表明扩增效率相似。 但如果找不到扩增效率相近的合适看家基因，则首选标准曲线法。

总之，标准曲线方法利用已知浓度构建的参考曲线，而比较 Ct 方法比较样品和校准器之间的 Ct 值。 两种方法都有其优点和注意事项，选择取决于实验设置和可用资源。

荧光标记在用于检测和定量扩增的 DNA 或 RNA 的实时 PCR 中起着至关重要的作用。 实时 PCR 中两种常用的荧光标记物是 Taqman Probe 和 SYBR Green。 以下是有关这些标记的一些信息：

Taqman Probe 是一种用于实时 PCR 的水解探针。 它由一个寡核苷酸组成，报告染料通常是荧光素 (FAM)，附着在 5' 端，淬灭染料，如四甲基罗丹明 (TAMRA)，附着在 3' 端。 该探针被设计为与被扩增的 DNA 或 RNA 中的特定目标序列互补。

在扩增过程中，Taq 聚合酶与目标基因序列结合并开始延伸 DNA 链。 随着延伸发生，Taq 聚合酶的 5' 核酸酶活性会降解 Taqman 探针。 这种降解将报告染料与淬灭剂分开，使报告染料能够发出荧光。 荧光强度的增加与目标基因的扩增成正比，提供了有关目标的定量信息。

SYBR Green 是一种荧光染料，可与双链 DNA 的小沟结合。 当与 DNA 结合时，SYBR Green 会发出强烈的荧光信号。 与溴化乙锭或吖啶橙等其他染料相比，它具有更高的信号强度。

SYBR Green 的优势在于它提供了每个扩增循环的数据，也可用于分析扩增产物的解链温度。 这使其成为实时 PCR 检测的热门选择。 然而，与 Taqman Probe 相比，SYBR Green 的缺点之一是缺乏特异性。 SYBR Green 可与任何双链 DNA 结合，因此它可能会从非预期的 PCR 产物或引物二聚体中产生非特异性信号。

综上所述，Taqman Probe 由于其探针-目标杂交和降解机制而提供更高的特异性，而 SYBR Green 在数据分析方面提供更大的灵活性，但存在非特异性信号检测的风险。 荧光标记的选择取决于实验的具体要求，包括灵敏度、特异性和数据分析需要。

与传统 PCR 方法相比，实时 PCR (RT-PCR) 具有多项优势。 以下是实时 PCR 的主要优势：

这些优势突出了实时 PCR 的效率、准确性和多功能性，使其成为各种研究领域、临床诊断和分子生物学应用的强大工具。

实时 PCR (RT-PCR) 也有一些应该考虑的缺点。 以下是实时 PCR 的主要缺点：

考虑到这些缺点，在为特定应用选择合适的技术时，权衡实时 PCR 的优点和局限性非常重要。

实时荧光定量PCR（RT-PCR）在各个领域有着广泛的应用。 以下是实时 PCR 的一些主要应用：

这些应用证明了实时 PCR 在各个科学领域的多功能性和重要性，有助于分子生物学、诊断学、基因工程和疾病研究的进步。

Real-time PCR，也称为定量PCR（qPCR），是一种分子生物学技术，用于在PCR过程中实时扩增和定量特定的DNA或RNA序列。

在常规 PCR 中，扩增结果在反应完成后进行分析，而实时 PCR 允许在反应过程中连续监测扩增过程并对目标 DNA 或 RNA 进行定量。

实时 PCR 需要具有测量荧光信号能力的热循环仪、目标序列的特异性引物、DNA 聚合酶、荧光探针或染料，以及含有目标 DNA 或 RNA 的样本。

实时 PCR 具有多种优势，包括目标序列的快速扩增和定量、高灵敏度和特异性、广泛的定量动态范围以及同时分析多个目标的能力。

实时 PCR 广泛用于通过量化样本中存在的 mRNA 量来研究基因表达。 它允许研究人员测量不同条件下或不同组织中基因表达水平的变化。

实时荧光定量PCR中常用的荧光标记包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标和杂交探针。 这些标记物与扩增的 DNA 或 RNA 结合并发出荧光信号，在反应过程中可测量这些信号。

实时 PCR 中的数据分析涉及确定循环阈值 (Ct) 值，该值表示荧光信号超过预定义阈值的循环数。 Ct 值用于量化样品中目标 DNA 或 RNA 的初始量。

是的，实时荧光定量 PCR 通常用于病原体检测，包括病毒、细菌和寄生虫。 它具有高灵敏度和特异性，可以快速准确地鉴定临床样本中的传染源。

实时 PCR 中的绝对定量通过将 Ct 值与使用已知浓度生成的标准曲线进行比较来确定样本中目标 DNA 或 RNA 的确切数量。 相对定量将目标基因的表达水平与参考基因或对照样本进行比较，而无需确定绝对拷贝数。

是的，通过设计针对突变序列的特异性引物和探针，实时 PCR 可用于检测和量化基因突变。 这使研究人员能够识别和量化样本中突变等位基因的存在。