【实验技术笔记】RNA 抽提 + 反转录PCR + PCR引物设计 + RT |
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文章目录
1. RNA 抽提
2. 反转录 PCR (rtPCR)
3. PCR 引物设计
4. RT-qPCR
1. RNA 抽提
TRIzol 作用原理 ● TRIzol 法的优点: 快速 能抽提多种属总 RNA 对少量的组织和细胞以及大量的组织和细胞都能有效分离 能抽提不同分子量大小的多种 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染 抽提出来的 RNA 适用于多种实验RNA 抽提前的准备 ● 试剂耗材准备: ● 样品准备: RNA 抽提流程
RNA 质量检测 1、分光光度计测定:Nanodrop 2000、Agilent 2100 RNA 在 260nm 处有最大吸收峰,通过测定样品的 OD260、OD280,可以估计样品的含量和纯度。OD260 为 1 的溶液含有 40ug/ml。 纯的 RNA 其 OD260/OD280 应为 2.0,如果比值偏小,则有机溶剂或蛋白污染较严重。如果比值偏大,则 RNA 可能已发生降解。 以吸光度值估计 RNA 含量和纯度并不十分可靠。需要结合其他方法综合判断。2、凝胶电泳法: 配制 1.2% 琼脂糖凝胶。将样品加上 RNA loading buffer 后加入上样孔电泳。电泳液用新鲜的 1×TAE 即可。 ◆ RNA loading buffer 配方: 紫外下拍照可以看见 3 条带,从上往下依次是 28s RNA、18s RNA 和 5sRNA。其中 28s RNA (5kp) 应为 18s RNA 亮度的 2 倍且没有涂抹状条带,这样的 RNA 质量是过关的。 吸光度测定法来不能区分 DNA 和 RNA,而电泳法如果看到上样孔内亮亮的,那通常为污染的 DNA。如果 DNA 会干扰后续实验,可以用 DNase 消化去除。 可以通过与 marker 比较估计 RNA 含量。(marker 通常会告诉上多少量的 marker,最亮条带相当于多少量的 DNA,例如 DNA marker 最亮条带是 1ug,上样量约 1.5ug, 因此将 RNA 条带亮度与 marker 对比,可大概得知 RNA 的量。) ![]() 01 反转录 反转录实验原理: 根据不同情况选择不同的反转录引物: (1)RNA 有 polyA 尾:用 Oligo(dT) 作为反转录引物,要求 RNA 质量好,否则 poly(A) 尾可能降解,造成全长 cDNA 合成量大大减少。 (2)RNA 没有 polyA 尾:如原核生物 RNA、真核生物 |
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