概述

实时荧光定量PCR（Real -time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是指在PCR反应体系中加入化学荧光物质，利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用化学荧光物质的不同，qPCR可分为荧光染料法（SYBR Green Ⅰ）和荧光探针法（TaqMan）。SYBR Green Ⅰ染料可以和任何dsDNA结合，缺乏特异性，qPCR反应中若有非特异性扩增产物，会增加荧光值，影响定量结果的准确性，而探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题。

TaqMan实时荧光定量PCR基本原理

TaqMan实时荧光定量PCR依据荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）原理，即在PCR扩增中加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团；当探针完整地结合在DNA单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。qPCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性将探针水解酶切，使得报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到监测PCR产物扩增量的目的。该方法具有特异性强、灵敏度高等特点，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。

TaqMan实时荧光定量PCR的特点

1.特异性强

在探针法qPCR中，除加入引物外还增加一条特异性探针，当引物和探针都与靶基因结合时，扩增时探针才会被水解酶切发出荧光；当引物发生非特异性扩增时，探针不会结合到非特异性片段上，因此不会被水解酶切而发出荧光，从而提高了特异性。

2.准确度和灵敏度高

对于低拷贝或者低浓度样品，相比于染料法，探针法避免了引物二聚体的荧光信号干扰，提升了检测的准确度，并且探针法可检测低至单拷贝样品，灵敏度高。

3.可用于多重qPCR检测

依据探针修饰的荧光基团不同，可用于多重实时荧光PCR，即在一个反应管中用多个荧光基团来区分不同靶基因。该方法的优势在于：①同时检测多个靶基因，提高检测效率；②如果将多重qPCR扩增的靶基因之一设为内质控，则可为实时荧光PCR检测提供假阴性的内部质控，以判断检测有阴性结果的有效性。

探针设计原则

实时荧光定量PCR实验体系的设计对于整个检测的成功非常重要，其中探针的设计是实验的关键，应根据其特性进行设计以适应相应要求。

1、TaqMan探针位置尽可能靠近扩增引物，但不能与引物重叠。

2、TaqMan探针长度一般为25~32 bp之间，最好不要超过40 bp。

3、TaqMan探针的Tm值应比引物的高5~10℃，确保引物延伸时探针完全结合在模板上；引物Tm值通常在60℃左右，探针Tm值通常在65~70℃。

4、TaqMan探针5’端第一个碱基不能是G，因为探针水解酶切后G碱基也能够淬灭荧光基团所发出的荧光信号。

5、避免探针内部形成发夹结构以及探针间三个碱基以上互补，同时避免与引物有三个碱基以上互补。

6、TaqMan探针中C最好比G多，相反则选择其互补链；同时避免单一核苷酸成串，尤其是GGGG。

7、目前常用的引物和探针设计有Primer Express、Primer 3、Beacon Designer 2.0和NCBI。

常见修饰基团类型

对于Taqman探针荧光修饰基团的选择，首先要保证荧光报告基团的最大激发波长（Excitation wavelength，Ex）和最大发射波长（Emission wavelength，Em）与qPCR仪器相匹配；其次淬灭基团的吸收光谱与报告基团的发射光谱有重合。以下是常用的修饰基团类型。

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