1：为什么不能使用高温加速实验验证RNA病毒的保存时间周期？     市场上有众多保存液宣传能保存新冠病毒室温下1个月之久，而实际上保存效果不理想，我们发现调研厂家给出的数据往往是在50-60度下加速2-4天得出的实验结果，按照 《Evaluatuon of Stability of In Vitro Diagnostic Reagnets; Approved Guideline EP 25-A  Vol.29 No.20 Replaces EP 25-P Vol.28 No.32》，《Stability testing of in vitro diagnostic reagents, BS EN 13640:2002》等文件的规范，样本保存液、核酸提取纯化试剂可以使用加速热稳定性去验证其半衰期和保存期效，但是细胞、核酸、蛋白质等生物样本的保存周期则并不能用加速老化来推算其常温的稳定性，这是因为存在于临床样品中的内源核酸酶在特定条件下下不起作用，如白细胞RNA酶具有在pH6.5具有最佳活性，但在pH5.0并且在56度下加热30min后可以抑制RNA酶90%以上的活性，然而室温下临床样品中RNA很快被内源性核酸酶降解。RNA酶A、B、C和T1在200mM DTT，60度下加热10min后活性大大降低，但是同样在室温下即是存在200mM DTT，RNA酶活性依然有足够的活性。

2：为什么不推荐含有乙醇、异丙醇的灭活保存液     医用酒精可以快速灭活新冠病毒，低浓度的异丙醇也可以有效杀灭新冠病毒或降低感染性。很多厂家提供的灭活型保存液中含有乙醇或异丙醇，甚至是两种都有，这些产品的灭活性能还是非常可以的，但是带来了一个新的问题，即与下游的磁珠法或柱法的核酸提取试剂兼容性问题。很多人认为下游的提取试剂中本身就含有胍盐和醇类，保存液中含有胍盐和醇类并不会影响下游提取环节。经过我们的调研发现市场上的核酸提取或纯化试剂盒中的胍盐、醇与磁珠都是精心配制过的，不同浓度的胍盐、醇的含量（10-40%）和磁珠类型与核酸的结合密切相关，样本保存液中的乙醇会改变提取试剂中厂家优化过的配比，有些情况下会大大降低其提取效率，造成假阴性。本公司样本保存液中不含醇类，与下游使用的磁珠法和柱法核酸提取或纯化试剂盒兼容性好。

3：能否使用RNAlater作为新冠病毒的灭活保存液？     Ambion旗下 RNAlater® 是水溶性、无组织毒性的保存试剂，可快速渗透到组织中，固定并保护细胞RNA。它可以迅速灭活RNA酶，稳定组织或细胞中的RNA，RNA在RNAlater®作用下 37°C 下可稳定1天, 25°C 下1周, 4°C 下1个月, -20°C 下无限期。但RNAlater®主要用于保护细胞和组织中的RNA稳定，并维持组织和细胞的完整形态，对于传染性病原体的保存并未有系统报道，且RNAlater®灭活RNA酶的作用是可逆的，并且在提取时需要将细胞离心并把RNAlater®去除，这不利于下游自动化提取RNA。我们不推荐使用RNAlater®或者其他类似组分的试剂去作为Covid-19的保存液。

4：RNA保存、制备和提取过程中困难     RNA的质量极大地影响了通过许多不同的分子生物学技术分析时获得的结果，例如RNA印迹，核糖核酸酶保护测定和RT-PCR（逆转录酶-聚合酶链式反应）。降解的RNA将产生比同等完整RNA样品中更低的信号。RNA比DNA更容易降解，当暴露于高pH，金属阳离子，高温和污染核糖核酸酶的条件下时，RNA易于水解。RNA降解的主要原因是核糖核酸酶污染，几乎所有RNA相关程序都必须加以防范，包括RNA分离，mRNA纯化，RNA储存，RNA印迹，核酸酶保护试验，RT-PCR，体外转录和RNA诊断。除了来自细胞和组织的内源性核糖核酸酶之外，空气中的尘埃颗粒中的手指油脂和细菌、真菌是核糖核酸酶的常见来源。为了尽量减少核糖核酸酶污染，在处理RNA时必须采取适当的预防措施。核糖核酸酶难以灭活，例如，牛胰腺核糖核酸酶A（RNase A）在90℃时没有活性。但是，如果酶迅速冷却至25℃，活性完全恢复，该过程称为可逆热变性。此外，已经有报道发现核糖核酸酶甚至可以在一定程度上经受高压灭菌（121℃，15psi，15分钟）。该报道测试了RNase A的稳定性并得出结论，它对热，pH极端和蛋白质变性剂尿素稳定，结果强调了研究人员灭活核糖核酸酶的困难。

5：本公司样本保存液的技术说明     样本保存液（长效、灭活型病毒样本保存 ）Cat# CSS00121  已经通过RT-PCR测试结果表明其可以保存单独的COVID-19-pseudovirus在室温下60天稳定，并且该保存液具有快速灭活病毒的能力（瞬间灭活），适用于唾液、拭子、痰液、血浆、血清、粪便等多种样本中的病毒核酸保存。

    样本保存液（灭活型）Cat# CSS01921 已经通过RT-PCR测试结果表明其可以保存单独的COVID-19-pseudovirus在室温下14天稳定，并且该保存液具有快速灭活病毒的能力（1min灭活），适用于拭子样本中的病毒核酸保存。

    样本保存液（胍盐灭活型）Cat# CSS02221 已经通过RT-PCR测试结果表明其可以保存单独的COVID-19-pseudovirus在室温下14天稳定，并且该保存液具有快速灭活病毒的能力（1min灭活）适用于拭子样本中的病毒核酸保存。

    样本保存液（一步法直扩型）Cat# CSS02321 已经通过RT-PCR测试结果表明其可以保存单独的COVID-19-pseudovirus在室温下7天稳定，并且该保存液具有快速灭活病毒的能力（2min灭活），此外该保存液不含PCR抑制剂， 可以配套一步法核酸检测试剂盒进行使用 。

    此外我们也通过实验验证其可以抑制0.01-0.1U/mL 的RNase A的活性。但真实Covid-19样本往往是复杂的，拭子采集的鼻腔和呼吸道细胞中，不仅含有白细胞、上皮脱落细胞，还有其他的细菌等微生物，且RNA酶的种类是多样的，不仅如此，现在采样中又出现“5混拭子”、“10混拭子”，尽管我们在不断努力地测试样本保存液对于各种复杂样本的的耐受性，我们还是建议检验人员尽快进行检测。     本公司的样本保存液的实验数据正在不断更新中。   参考文献 [1] Arts et al., Nucleic Acids Res., 25:311-317, 1997. [2] Brady and Iscove, Methods Enzymol., 225:611-623, 1993. [3] Busche et al., J. Am. Pathol., 157:605–61 1, 2000. [4] Compton, Nature, 350:91-92, 1991. [5] Elbashir et al., Methods, 26:199-213, 2002. [6] Fink et al., Am. J. Pathol., 157:1459-1466, 2000a. [7] Klebe et al., BioTechniques, 21:1094-1 100, 1996. [8] Liss, Nucleic Acids Res., 30:89, 2002. [9] Liet al., J Dent Res., 83(3):199-203, 2004. [10] Lockhart et al., Nat. Biotechnol., 14:1675-1680, 1996. [11] Matsubara et al., Hum. Immunol., 35:132-139, 1992. [12] Mesink et al., Br. J. Haematol., 102:768-774, 1998. [13] Myers et al., Biochemistry, 30:7661-7666, 1991. [14] O'Leary, Clin. Chem., 45:449-450, 1999. [15] Phillips and Eberwine, Methods, 10:283-288, 1996. [16] Retzel et al., Biochemistry, 19(3):513-518, 1980. [17] Yan et al., Anal. Biochem., 304:267-270, 2002.