核糖体图谱(Ribo-seq)，由Ingolia等人2009年Science上首次发表。从另一个角度研究翻译。用低浓度的核糖核酸酶(RNase)处理细胞裂解物，使mRNA降解，但核糖体保护的RNA片段除外。然后，用下一代测序(NGS)分析22-35 nt的mRNA片段(即核糖体足迹：RFPs)，相当于核糖体保护片段(RPFS)，以揭示核糖体的位置和密度。基于位置信息、核糖体在每个转录本上的分布和密度，可以推断出诸如起始密码子位置(包括非ATG起始)、密码子使用偏差、上游ORFs(uORFs)和翻译暂停景观等信息。这些方面不能用其他翻译方法来研究。2016年，发展了一种优化的Ribo-seq方法-超分辨率核糖体剖面分析(super-resolution ribosome profiling)，该方法能够在单个转录本中观察到强大的全局的3nt周期性。此外，这种方法提高了Ribo-seq揭示小ORF(sORFs)和未注释的新编码区的能力，可能编码来自注释的非编码RNA和假基因的蛋白质。核糖体图谱中使用的核糖核酸酶(Ribonuclease)也被考虑在内，发现核糖核酸酶T1(RibonucleaseT1)是最能保持核糖体完整性的酶，同时也能将多聚体转化为单核小体。Ribo-seq的一种变体是翻译复杂轮廓排序(translation complex profile sequencing:TCP-seq)。用甲醛交联快冷酵母细胞，使其与mRNA的翻译复合物在其天然位置停滞，然后对其进行RNase消化。然后用蔗糖梯度超速离心分离全核糖体和小亚基(SSU)，并对这些片段上长达250nt的RNA片段进行测序，分别在翻译的起始阶段、延伸阶段和终止阶段得到自然分布的图谱。该方法能够观察mRNA的5'非翻译区(UTR)上的SSU足迹，并捕捉任何类型的核糖体-mRNA复合体在翻译的各个阶段的位置。

然而，Ribo-seq实验复杂又昂贵的。与RNC-SEQ相比，它需要大量的细胞作为起始材料。由于所有物种的Ribo-seq都需要基于杂交的rRNA耗竭，Ribo-seq通常仅限于几种模式生物。对于许多其他物种，尤其是种类繁多的细菌，Ribo-seq由于缺乏rRNA探针而难以执行，而rRNA探针的昂贵定制似乎是唯一的选择。许多其他因素影响RFP的数量，例如伪RPF。由于Ribo-seq主要分析编码序列(CDS)，其中核糖体与mRNA结合。与翻译调节高度相关的非翻译区(UTR)不能被有效地分析。此外，Ribo-seq经常生成许多被比对到非编码RNA的“RFP”，这表明相当大的假阳性率。

另一个缺点是RFP长度短(原核生物为24~26 nt，真核生物为28~30 nt)，受核糖体大小的限制，不能进一步延伸。为了获得中等丰度的mRNAs的足够覆盖范围，需要扩大测序量(通常每个样本的reads数超过1亿)，这意味着测序和计算成本很高。尽管如此，许多翻译事件，特别是剪接变体和环状RNA的剪接连接仍然很难被覆盖。拼接比对算法在这些短读取中检测连接点的效果较差。相反，全长的RNC-seq序列是整个mRNA的序列；因此，较长的读数长度是适用的。较长的reads导致几乎完全覆盖大多数翻译mRNA，包括低丰度的mRNA。这样就可以有效地检测和量化连接，例如，翻译BDP1和BRF1的各种剪接变体以及翻译循环RNA CircLINC-PINT，这些使用Ribo-seq几乎是不现实的。

值得强调的是，RFP的密度并不代表翻译活性。RFP密度与平移起始率成正比，与延伸率成反比。如果翻译完全停滞在某一mRNA上，则RFP将在该mRNA中高度富集，但翻译活性为零。