全文2800字，伤脑筋……

今天尝试把自己对于 stranded、reverse-stranded、un-stranded 这个问题的理解给讲清楚，有不对的地方还请大家批评指正，相互交流学习~

其实这个问题的是伴随着链特异性测序的兴起而产生的，那么为什么要有链特异性测序呢？

我们都知道DNA有两条链，很自然的我们就想把这两条链给区分一下，所有就有了各种链的定义：

正负链 正负链这个定义实际上很“人为”，在参考基因组中，DNA的一条链被指定为正链，另一条链就被指定为负链，这个指定是大家都保持一致的，即通用，我们所使用的参考基因组都是正链的序列。在文献中往往被翻译为：正链（forward strand; plus strand）与负链（reverse strand; minus strand）。

模板链、非模板链 在转录过程当中，与RNA结合，充当转录模板的那条DNA链，我们称之为模板链，自然另外那条链就称为非模板链。简单来说，模板链是与RNA互补的那条DNA链，非模板链是与RNA序列相同的那条链（这样说不严谨，但是方便大家理解）。

正义链、反义链 接着前面的，正义链就是和RNA序列相同的那条DNA链，反义链就是和RNA互补的那条DNA链。在文献中往往被翻译为：正义链（sense strand）和反义链（antisense strand）。

编码链、非编码链 接着前面的，编码链就是和RNA序列相同的那条DNA链，非编码链就是和RNA互补的那条DNA链。在文献中往往被翻译为：编码链（coding strand）和非编码链（noncoding strand）。

难以理解……上图：

总结起来： 非模板链 = 编码链（coding strand）= 正义链（sense strand) 模板链 = 非编码链（noncoding strand） = 反义链（antisense strand）

为什么要有链特异性测序？答案就是：

"With non-stranded RNA-Seq, you can't tell whether a sequencing read represents the plus or minus strand of the DNA template. In comparison, stranded RNA-Seq distinguishes the first and second strands of cDNA."

总结来说，链特异性测序有这几个优点是链非特异性测序所不具备的：

设想分别位于正负链上的两个基因有一个共同的区域（overlap gene），那么如果我们用链非特异性测序：

详细讲一下该图的建库流程： （1）oligo-dT富集：我们一般说的RNA-seq是指mRNA，但是我们提出来的总RNA有接近90%全部是rRNA，我们只想得到mRNA，利用真核生物mRNA一般都带有polyA的尾巴这一性质我们设计oligo-dT去与这个polyA的尾巴进行杂交，就能把我们想要的mRNA给富集出来。

（2）添加随机引物进行链的合成：这个过程实际上就是一个DNA双链的合成，无论你起始的mRNA是上面的哪一条，最终形成的两条DNA双链基本是一样的（考虑到随机引物的结合位置，两个DNA分子会有差异）。

（3）添加接头：我们最终会使用illumina进行测序，从这一步开始实际上已经开始构建测序文库了，这里添加的是“Y”接头，注意，这个接头并不是互补配对的，从图里就可以看出，是“Y”字形，显然不是互补配对的。但是你会发现，紫色的接头是都位于5'端的，而红色的接头则都是位于3'端的。

（4）PCR扩增：这一步扩增的引物结合位点是在前面的接头中的，而不像前面的随机引物了。可以看到，左右两边都扩增产生了两个DNA分子，我们通过添加read1的测序引物就能测得read1，同理，添加read2的测序引物就能测得read2。但是在这里你就会发现一个尴尬的问题，无论是左边还是右边，read1测出来的序列并不一样，拿左边举例，上面那个DNA分子测出的序列为浅灰色的序列，即Plus Stranded mRNA的互补链，而下面的DNA分子测出来的序列为深灰色的序列，即和Plus Stranded mRNA序列一样的那条链。这样在同一个库中，你最后得到的read1你也不知道它到底和mRNA之间的关系是怎样的，所以就是链非特异性了。

但是当我们换成链特异性测序：

以Plus Stranded mRNA举例：首先还是以mRNA为模板进行第一链的合成，然后在利用RNaseH对杂合链中的RNA进行降解，再利用含有dUTP的反应液进行第二链的合成，添加接头。来看它是如何实现链特异性的：

（1）第一种方法是，我使用能够特异性降解含有尿嘧啶（U）的酶来对含有U的链进行降解，然后再进行链的合成，这样，我的文库里面显然只会有一种DNA分子，我测出来的read1自然就肯定是mRNA的序列（在这张图里）。 （2）第二种方法是，将含有U的DNA双链解开，进行扩增，但是DNA聚合酶没有办法以U为模板进行扩增，所以最终所有的DNA分子也只有一种，就是DNA聚合酶以没有U的DNA单链为模板合成的DNA分子，这个时候测出来的read1显然也只能是mRNA的序列。

通过上面的方法，你就能知道你的read1到底是测的哪条链，就实现了真正的链特异性测序了。

这个问题实际上来源于我在使用featureCounts进行定量时的一个选项，下面是这个选项的描述：

好了，上面的清楚了，但是同样是这样的一个问题，不同的软件……它有着不同的描述，例如 TopHat 就不是用 stranded 和 reversely stranded 来定义（这也是我认为最好相通的），它用 first stranded 和 second stranded 来定义这件事，它的 first stranded 表示 read1测到的是antisense strand的信息！，second stranded 表示 read1测到的是sense strand的信息！这在我看来……是很奇葩的，是很容易搞混淆的。

下面用一张图进行一个汇总，实名感谢这篇帖子Strandness in RNASeq，应该是全网讲的最清楚的了：

细心的人会注意到上面的 TopHat 参数中有个 fr，这又是什么……？

先上图（图片来源：https://www.biostars.org/p/344264/）：

我就遇到过测出来的反而是antisense strand的信息的情况，这是一个PRO-seq的单端测序数据，首先在igv上看一下：

上面那张表，不同的建库方式就会有不同的结果，总结一下：

下面尝试理解为什么 dUTP 建库为 reversely stranded ，而 Ligation 建库为 stranded 。针对这个问题的理解，最多的就是这个图了：