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细胞程序性死亡往往涉及到非常精细的信号调控，在生理病理过程中以多种多样的方式发挥着不可或缺的影响。坏死样凋亡（necroptosis）是细胞程序性死亡的一种形式，参与了炎症和退行性疾病的发病机制[1]。在肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）所介导的细胞坏死样凋亡过程中，关键蛋白RIP1和RIP3形成的坏死小体复合物（necrosome）是重要的信号处理枢纽。然而坏死小体在细胞中究竟是如何精准处理复杂信号进而决定细胞死亡命运，仍属谜团；甚至仅论学界对坏死小体结构的认知，都尚存许多空白。

2022年3月7日，韩家淮院士和陈鑫副教授团队在Nature Cell Biology杂志上发表了文章Mosaic composition of RIP1-RIP3 signalling hub and its role in regulating cell death，借助单分子定位超分辨成像技术“随机光学重建显微镜（STORM）”，首次在细胞原位揭示了坏死小体这一坏死样凋亡关键枢纽的纳米尺度组装特性，以及该组织结构对细胞死亡信号的决定作用。

坏死小体结构研究的难点与突破

在过往研究中，控制肿瘤坏死因子（TNF）诱导的坏死性凋亡的信号通路已被鉴定：TNF促使关键蛋白受体相互作用蛋白1和3（RIP1&RIP3）形成一个促坏死样凋亡复合物，也即“坏死小体”，进而招募并激活下游效应蛋白MLKL；MLKL转位到质膜上，诱导细胞裂解死亡[2-6]。

显然，此过程涉及到多个核心分子（RIP1/RIP3/MLKL）的招募激活和信号放大/转变等复杂过程。想要研究其中的具体机制，坏死小体的结构解析是必要的。

目前针对单个蛋白质或简单蛋白质复合物的结构解析主流策略是X射线或单颗粒冷冻电镜技术，二者获得的结构解析精度非常依赖于研究对象的同质性（前者需要结晶，后者需要整合大量相似结构生成最后结果）。然而，韩家淮院士和陈鑫团队发现坏死小体在细胞内呈现明显的异质性，即不同的蛋白质复合物在物理尺寸和结构组成上存在较多差异。

学界此前对于坏死小体结构的认知主要来源于针对RIP1和/或RIP3 RHIM结构域淀粉样属性的体外研究[7,8]。目前可用的信息不足以预测坏死体的整体结构，也没有关于发生坏死性凋亡的细胞中功能性坏死体结构的信息。

韩家淮院士和陈鑫副教授团队借助于蓬勃发展的超分辨成像技术（2014年诺贝尔化学奖），尝试了多种目前较成熟的技术流派（SIM，Airyscan，STED），最终聚焦于由哈佛大学庄小威实验室发展并命名的单分子定位超分辨成像技术：随机光学重建显微镜（STORM）[9]。

随机光学重建显微镜 (STORM) 是一种基于单分子的超分辨率成像技术，通过多次随机激发单个荧光分子，获取其精确空间定位并叠加大量数据生成最终图像，可突破光学分辨极限，允许以数十纳米 (nm) 的光学分辨率对生物系统进行可视化，比传统共焦成像的分辨率高10倍以上。

“在我们尝试过的多个超分辨技术类型中，STORM最大的优势在于分辨精度较高（平面13-18 nm定位精度），适合解析坏死小体这样尺度在100 nm以上的大型生物大分子复合物。”陈鑫副教授介绍。

STORM技术从2006年诞生以来，一直都在不断发展成熟。但要将它实际应用到细胞原位的坏死小体观察中，获得高质量的超分辨成像结果，仍需要在样品制备、染色标记、数据采集以及后期处理等各环节进行细致优化。

“任何一个步骤的不足都会直接导致最终结果的不完美。这里面需要研究者具有必要的多学科基础积累（生物-样本；化学-染料；物理-光学），我们相当部分时间/精力花在了这些地方，也走了不少弯路，目前还在进一步提高优化过程中。”经过历时8年的探索、研究与优化，韩家淮院士和陈鑫副教授团队首次实现了在细胞原位揭示了坏死小体纳米尺度上的组织模式以及其在细胞命运决定中的重要作用。

坏死小体的马赛克样组织结构

团队成功观察到：死亡细胞中的坏死小体由初始点团样结构演化为规则的棒状结构（直径约50 nm，长度约200~600 nm）的组装模式，并且在该规则棒状结构中呈现出明显的由RIP1/RIP3同源寡聚体组成的马赛克状(Mosaic)分布，如下图所示。

进一步的分子机制研究揭示：马赛克分布中的RIP3区域需要满足一定的尺度要求（如四聚体及以上），才能有效地诱导下游效应分子MLKL发生多聚化，进而靶向细胞膜导致细胞死亡发生。这一“尺寸阈值”的发现揭示了功能性 MLKL 寡聚体所需的 RIP3-MLKL 相互作用的缺失步骤。

通过抑制关键因子RIP1的激酶活性不仅可以抑制RIP1自身的磷酸化与多聚化，还可以阻碍坏死小体的有序马赛克样棒状结构的产生，抑制细胞死亡。有趣的是，尽管RIP1或RIP3单独过表达可以形成相应的同源寡聚体，分别触发细胞凋亡和坏死样凋亡，但RIP3激酶活性缺失导致的细胞死亡模式转变（坏死样凋亡→凋亡，necroptosis→apoptosis）也有赖于该结构中的RIP1多聚化程度，提示团队发现的坏死小体马赛克样组织结构很可能是细胞内控制死亡方式的信号选择模块（signaling divarication）。

以上结果在细胞原位揭示了坏死小体这一关键信号枢纽纳米尺度的完整有序结构与细胞程序性死亡控制之间的明确联系，为未来通过特异性抑制程序性细胞死亡从而对相关人类疾病进行治疗干预提供新的思路。

看到纳米尺度光学成像

解析生物大分子复合物的可行性

坏死小体复合物所具备的这种蛋白质信号枢纽的异质性，很可能是细胞内的一种普遍现象，与细胞应对各种内外刺激信号的网络调节功能有关。因此，如前文所述，目前的主流策略（X射线或单颗粒冷冻电镜技术）在解析细胞内结构巨大、成分复杂、高度异质的功能复合物（如DNA复制/转录起始复合物、mRNA翻译起始复合物等）时，都存在着较明显的局限性。

韩家淮院士和陈鑫副教授团队的工作证明纳米尺度光学成像是解析此类大型生物大分子复合物的组织特征和功能模式的可行方案之一。

而对于超分辨成像技术领域，韩家淮院士和陈鑫副教授团队的成果同样具有借鉴意义。

“已有的超分辨成像大多局限于生物学问题属性不够明确的细胞骨架等结构的展示。我们的成果给出了一个很好的研究细胞信号枢纽原位组织模式的范例，并对所观察到的精细结构进行了生物学功能解读，为今后研究生命活动中数量巨大的生物大分子信号枢纽的细胞原位结构和功能提供了一个有益的借鉴。”陈鑫副教授向果壳记者介绍道,“我们将进一步优化升级现有成像平台，聚焦程序性死亡等细胞应激重要信号网络，侧重利用单分子定位显微镜（STORM）等前沿成像技术解析丰富多彩的生物学问题。”

他提到，STORM技术未来至少在以下几个方面有改进的空间：

a. 三维空间分辨率，如提高至单纳米定位精度显微技术，目前以MINFLUX/ROSE等技术为代表；

b. 多通道信号解析能力，如发展合适的荧光染料或数据采集策略；

c. 活细胞超分辨成像，现有单分子定位超分辨成像策略主要针对固定细胞。

单分子定位显微技术不仅在基础科研领域具有重要价值，其在临床应用方面也有可以拓展的空间，如利用其高检测灵敏度辅助CAR-T肿瘤免疫治疗[10]。团队未来将持续关注该技术的发展和应用。

致谢

感谢陈鑫副教授对本文的审阅与建议。

陈鑫老师借我是科学家平台发出诚挚邀请：欢迎有相似理念的同学加入（硕士/博士研究生）团队，一起努力，共同成长。联系邮箱：[email protected]

参考文献

[1]Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M. & Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Bio 18, 127–136 (2017).

[2] Zhao, J. et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5322–5327 (2012).

[3]Cai, Z., Jitkaew, S., Zhao, J. et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol 16, 55–65 (2014).

[4]Wang, H. et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Mol. Cell 54, 133–146 (2014).

[5]Dondelinger, Y. et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Rep. 7, 971–981 (2014).

[6]Chen, X. et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24, 105 (2014).

[7] Li, J. et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell 150, 339–350 (2012).

[8] Mompeán, M. et al. The structure of the necrosome RIPK1–RIPK3 core, a human hetero-amyloid signaling complex. Cell 173, 1244–1253.e1210 (2018).

[9] Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods 3, 793–795 (2006).

[10]Nerreter, T., Letschert, S., Götz, R. et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun 10, 3137 (2019).

作者：竹子

编辑：酥鱼

排版：尹宁流

题图来源：陈鑫团队

研究团队

团队目前小而年轻，有四名硕士研究生在读：

汪文心

曹雅婷

马明睿

蒋香玲

论文信息

发布期刊 《自然·细胞生物学》Nature Cell Biology

发布时间 2022年3月7日

论文标题 Mosaic composition of RIP1–RIP3 signalling hub and its role in regulating cell death

（DOI：https://doi.org/10.1038/s41556-022-00854-7）

原标题：《韩家淮/陈鑫团队：首次揭示坏死小体与细胞死亡的联系，为未来人类疾病治疗干预提供新思路》

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