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4)体系中可能存在抑制剂影响酶的活性,建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。 2.扩增曲线无法达到平台期 基因丰度低、循环数较少,建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。 3. 扩增曲线平台期下降 可能是基线范围设置不当,这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值(一般建议设置为Ct值-4),调整后见下图。 4.扩增曲线平台期锯齿状 1)RNA纯度低,建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。 2)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。 5.扩增曲线杂乱无规律 可能是ROX浓度和机型不匹配,建议调整ROX浓度,调整后见下图。 【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE,取消ROX的校正功能,查看扩增曲线是否恢复正常,即可判定是否是ROX导致的。 6.有熔解曲线,无扩增曲线 可能是扩增程序设置错误,未进行荧光信号搜集,建议重新实验,增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。 7.扩增曲线有向上或向下的尖峰 可能是仪器故障,建议维修仪器。 8. 阴性对照有扩增 1)NTC有扩增,可能有以下两种情况: ①Ct>35,熔解曲线Tm值<80℃(一般正常qPCR产物,大小在100-300bp之间,熔解曲线Tm大多在80℃以上),可能是引物二聚体导致,可进一步优化引物。 ②有Ct值且<35,表示反应体系被污染,可逐步排除污染源。 2)NRC有扩增 NTC正常,NRC有Ct值,可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒(如Cat NO.11141ES)。 【注】NTC是指将H 2O代替模板的阴性对照反应;NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。 9.复孔重复性差 1)加样误差导致,建议移液器定期校准,另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。 2)模板量低,建议提高模板量,使Ct值落在15-30之间。 3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。 Part2 熔解曲线异常 熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性,理想的熔解曲线为单峰,异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况,下面我们来逐一分析。 1.熔解曲线出现双峰 1)双峰,杂峰Tm在80℃之前 ①可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。 ②可能是模板量过低,促使了引物二聚体的形成,建议提高模板量。 2)双峰,杂峰Tm在80℃之后 ①引物特异性过差导致非特异性产物扩增,建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。 ②gDNA污染,可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值,可重新制备模板。 2. 熔解曲线单峰但不尖锐 可能存在大小相近的非特异性产物,建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。 3.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前 推测未加模板,仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。 4.熔解曲线峰型杂乱 1)反应体系污染,结合NTC和NRC结果确认污染情况,建议从水,引物,酶和环境等逐一排除污染。 2)试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效,建议用新的试剂做对比实验。 3)仪器长时间未校准,建议定期进行仪器校准保养。 4)耗材与仪器不匹配,需确认对应仪器对耗材的要求。 5.有扩增曲线,无熔解曲线 可能是熔解程序设置错误,未搜集荧光信号,建议重新实验,增加熔解曲线阶段的信号搜集。 6.两种试剂平行对比,同一产物Tm值不同 可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样,导致同一产物解链温度Tm值不一样。 7.熔解曲线前端起杂峰 可能是ROX浓度与机型不匹配,建议取消ROX校正查看熔解曲线是否正常,调整后如下图。 【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE,取消ROX的校正功能,查看熔解曲线是否恢复正常,即可判定是否是ROX导致的。 全文转自BioArt。 感谢您的关注,祝您科研顺利! 1. 细胞增殖/毒性检测方法比较及CCK-8法活力测定 2. 定量PCR实验中熔解曲线不止一个主峰是什么原因? 3. 免疫组化IHC实验经验总结 4. SCI 文章回复信中常见问题怎么解决? 5. GraphPadPrism 8.0体验一个月后的分享! 6. 如何正确的获取和整理大量的实验数据? 7. 老鼠的编号方法怎么破? 8. 5步教你跑出漂亮的大分子western-blot图诀窍 9. 细谈流式细胞分选的原理及特点 10.Western blot 实验技术及常见问题分析 11. 【药理可投-IF4.23-年刊1500+】例文:吴茱萸碱通过激活自噬和抑制NLRP3炎性小体减轻结肠炎的损伤 12. 详解各种外科缝合法,图文并茂 ! 13. ELISA中常见问题及解决方法 14. 干货:WB, IHC实验问题总结与处理方案 15. 国自然技术路线图如何设计和绘制 16. NCBI,从一窍不通到略知一二 17. 以《自然》来举个例子,如何在顶级期刊上发表文章? 18. 最新国自然资源包含最新中标标书国自然写作指导大全,免费领取 19. Matrigel 使用常见问题分析 20. 免疫沉淀(IP)的常见问题及解答 目前100000+人已关注我们 粉丝福利领取: 本公众号后台回复: WB2021免费领取Western blot 实验详细操作步骤视频讲解从入门到精通全套资料 最好转发本文到你的朋友圈或者科研群,让更多的朋友学习到有价值的东西! 点了“在看” 的人SCI每投必接收 顺便点个“ 赞” ,祝您科研实验一切顺利! 返回搜狐,查看更多 |
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