PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。以单链DNA为模板，4种dNTP为底物原料，在引物引导的情况下，模板与底物通过DNA聚合酶的聚合延伸，多次重复后使DNA呈指数扩增复制。

（1）变性：是利用DNA在体外高温时变性，双链解离变成单链；

（2）退火：低温时引物与单链DNA按碱基互补配对原则结合；

（3）延伸：再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’- 3’)的方向合成互补链。

将这三个步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。

我们已知PCR扩增需要模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等，那么每个组分的作用是什么？值得注意的地方都有哪些呢？不要着急，我们一起来看一看。

模板的添加量、质量、结构等，与PCR扩增成败与否息息相关。

模板的最适添加量

模板的最适添加量通常取决于模板的复杂程度和目的基因拷贝数。25-30 Cycles循环，可以检测到大约10^4拷贝的目的基因序列。同时，也应结合使用的PCR Mix模板耐受度，参照说明书添加合适的模板量，以下是常规PCR Mix的推荐模板量：

（1）通常1 μg的人类基因组DNA含有3.04× 10^5 个DNA分子。对于大多数PCR反应来说，30~100 ng的人基因组DNA就已经足够。高拷贝的目的序列（如管家基因），只需要10 ng的模板即可。复杂度较高的模板添加量范围在10 ng~500 ng之间。

（2）通常1 μg大肠杆菌基因组DNA含有2× 10^8 个DNA分子，其模板推荐量在100 pg~1 ng之间。

（3）通常1 μg的λDNA含有1.9× 10^10 个DNA分子，其模板添加量可以少至100 pg。

（4）cDNA模板的数量取决于目的序列的拷贝数。cDNA添加量通常用等效RNA添加量来进行判断。通常建议cDNA模板稀释5-10倍后再进行PCR反应。

模板的质量

PCR扩增的模板包含DNA、cDNA、质粒、菌等。

DNA的来源可能是通过CTAB法、碱裂解法、试剂盒法等方法提取，采用试剂盒提取的DNA纯度和完整性较前二者方法提取的好，因此质量会更高，更容易扩增出目的基因。而CTAB法、碱裂解法提出的DNA可能会残留较多的有机试剂、蛋白质等杂质，容易抑制酶的PCR扩增。通常可进行稀释模板以达到稀释杂质的效果，或者选择耐脏性能较好的酶进行扩增。

cDNA由RNA反转录获得，因此其质量与RNA本身、反转录实验有关。反转得到的cDNA是一个混合物，无法简单通过测浓度、跑胶等判断其质量。通常以cDNA为模板扩增时，可稀释5-10倍以达到稀释溶液里的其他组分。

质粒通常采用试剂盒法提取，得到的质量都比较好。并且质粒相对DNA、cDNA来说，结构较为简单，大小也小得多，所以是很容易扩增的。

菌落/菌液如果直接进行PCR扩增，属于杂质含量较高的模板，通常建议使用耐受能力较好的taq酶来扩增，或是进行适当的稀释；此外，有些菌类如农杆菌、酵母的细胞壁比较厚，直接扩增难以得到良好的实验结果，可用NaOH加热处理后再进行PCR扩增，或者选用合适的方法提取基因组DNA后进行PCR扩增。

模板的结构

有些目的片段G、C两种碱基含量超过65%，或者局部G和C含量过高，这样的片段称为GC-rich片段。富含GC的区域容易形成反向重复，或发夹结构，使得模板变性更难、且退火时变性的模板更容易复性。因此，需要添加一些PCR反应增强剂（市面上通常成为GC buffer，PCR enhancer buffer），能够有效降低高GC模板和具有复杂二级结构模板的解链温度，促进高GC片段的PCR扩增。还可以通过改进PCR反应程序如提高变性温度、使用Tm值较高的引物(>68℃)方便在较高温度下进行退火、使用两步法扩增程序。

有些目的片段则是A、T两种碱基含量偏高，扩增此类目的DNA片段常用的方法是：将延伸温度从72℃降低到68-60℃。

引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素。PCR引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物容易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。

引物Tm值

引物Tm值用来评价DNA-DNA杂交链稳定性。了解Tm值对于确定适当的退火温度是至关重要的。过高的退火温度会导致引物-模板杂交不足，从而引起PCR产物产率低。过低的退火温度则可能导致非特异性产物的扩增。

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DNA聚合酶（DNA polymerase）是DNA复制的重要作用酶，可以催化合成DNA。以DNA为复制模板，将DNA由5'端开始复制到3'端。在PCR扩增里，我们常说的Taq酶和高保真酶（Pfu）就是DNA聚合酶。

DNA聚合酶的四大特点——特异性、热稳定性、保真度和合成能力，使这些酶具有多种功能，进一步拓展它们在PCR中的应用。

特异性

非特异性扩增是PCR反应最主要的障碍之一，因为它会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度。DNA聚合酶延伸错配的目的基因和引物二聚体，是非特异性扩增的常见来源之一。热启动DNA聚合酶是一种很好的降低非特性扩增的酶，在进行PCR扩增时其酶活性被封闭，直到温度至少超过70℃时才发挥作用；封闭酶活的方式一般有抗体修饰、化学修饰和配体修饰。

热稳定性

热循环是PCR扩增反应条件的关键特征，因此所使用DNA聚合酶的热稳定性非常重要。虽然来自于嗜热菌菌株的 Taq DNA 聚合酶可耐受相对较高的温度，但其半衰期在90°C以上时明显缩短。尤其是遇到上述所说的具有二级结构或富含GC序列的DNA片段（其变性需要长时间高温），这一缺陷便成为一大难题。因此，研究者从超嗜热菌分离出具有更高热稳定性的DNA聚合酶。

Pfu DNA聚合酶就是一种大家熟知的超耐热酶，来自于水热环境中的超嗜热古细菌 Pyrococcus furiosus 。在95°C下，Pfu聚合酶的稳定性比 Taq 聚合酶高20倍。其它常见的超耐热DNA聚合酶包括来自古细菌 Thermococcus 和 Pyrococcus 的KOD和GBD等。

保真度

DNA聚合酶的校正能力决定了保真度，会影响DNA序列复制的准确性。高保真DNA聚合酶的校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性。当错配的核苷酸插入聚合结构域，DNA合成将因不合适的碱基配对动力学而暂停。暂停期间，高保真DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并用正确的核苷酸替换。

通常，高保真DNA聚合酶的保真度表示为与 Taq DNA 聚合酶保真度的相对值。DNA聚合酶准确复制DNA序列（即获得无错误序列）的能力对分子克隆、测序和定点突变等实验应用至关重要。

合成能力

酶的合成能力可定义为在一次结合中处理的核苷酸数量。DNA聚合酶的合成能力通常反应了合成率和合成速度，以及酶与底物的亲和力。合成能力高的DNA聚合酶适用于扩增长模板、具有二级结构和富含GC的序列，以及存在肝素、木聚糖和腐殖酸等PCR抑制剂的血液和植物组织样品。

早期的高保真DNA聚合酶具有较强的核酸外切酶活性，所以合成能力较低，且会减慢聚合速度。例如，校正 Pfu DNA聚合酶的保真度是 Taq DNA聚合酶的7倍，但其合成率还不到 Taq聚合酶的一半。现今的高保真DNA聚合酶通常经过一定的改造，使之实现了合成能力的突破，同时不影响聚合酶活性。

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。

在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

Mg2+是热稳定DNA聚合酶所必需的辅助因子，dNTP-Mg2+ 与核酸骨架相互作用影响DNA 聚合酶的活性，对成功扩增具有重要意义。如果没有足够的游离Mg2+，PCR聚合酶的活性会降低。相反，过量的游离Mg2+会降低酶的保真度，并可能增加非特异性扩增。许多因素可以影响反应中游离Mg2+的数量，包括DNA模板浓度、样品中的螯合剂(如EDTA或柠檬酸盐)、dNTP浓度以及蛋白质的存在。

由于篇幅过长，我们将分期讲述《PCR扩增那些事》， 下一期内容：PCR扩增程序、PCR扩增常见问题与解决办法，敬请期待！

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