NCBI已经不再维护并下架了ePCR软件，转而推荐使用其Primer-BLAST网页工具。这对于单个引物设计任务比较方便，但不利于基因组较大的非模式物种的特异性引物设计或批量化的引物设计。

本教程讲解使用NCBI-ePCR和Primer3进行引物批量化设计。

首先，使用famap命令和fahash命令分两步将基因组序列转换为哈希数据库。

常用参数：-t 设置碱基类型。可以设置4种值：n，允许含有小写碱基atcgn，其它字符转换为n或N；nx，允许含有小写碱基和兼并碱基字符，其它字符转换为n或N；N，仅允许大写碱基，atcgn自动转换为大写，其它字符转换为N；NX，允许大写碱基和兼并碱基字符，其它字符转换为N。 -b 设置输出的famap数据库文件路径。

$ fahash -b genome.hash -w 12 -f 3 genome.famap程序进一步将famap文件转换为hash数据库文件。

常用参数：-b 输出hash数据库文件。-w 设置wordsize长度。-f 设置wordcnt长度。

然后，使用re-PCR将引物和数据库进行比对，寻找引物比对结果。

输入一对引物，并设置产物长度期望值，得到一对引物的匹配结果：$ re-PCR -s genome.hash -n 1 -g 1 ACTATTGATGATGA AGGTAGATGTTTTT 50-1000常用参数：-p 输入hash数据库，在命令行中直接输入引物序列，将引物和数据库进行比对。-s 输入hash数据库，在命令行中必须输入一对引物和产物长度期望范围，得到一对引物的匹配结果。-n 设置允许的错配碱基数。-g 设置允许的gap数。

Primer3是命令行形式的引物设计软件，能很好地用于引物的批量设计。 其主程序是primer3_core。 该命令的输入是Boulder-IO格式，适合于软件读入数据；输出文件默认下是适合人类阅读的格式，也可以是Boulder-IO格式，有助于下一步引物结果的批量操作。 Boulder-IO格式以文本形式记录着引物设计信息，且每个引物信息的结尾使用“等于换行符”分隔。每个记录由多个标签和对应的值构成，用于指定输入信息或输出结果。例如：

Primer3使用示例和参数：

常用参数：-p3_settings_file 用于输入primer3的配置文件。这是因为primer3可设置的参数太多了，将大部分参数放入到该配置文件，有利于参数的输入。primer3的默认参数不好，特别是默认参数下没有开启热力学计算。推荐使用配置文件来根据自己的需求来设定相关参数。此外，输入文件中的参数设置能取代此文件中的设定值。 此文件格式：第1行固定为"Primer3 File - http://primer3.sourceforge.net"；第2行固定为"P3_FILE_TYPE=settings"；第3行是个空行；从第4行开始则是标准的Boulder-IO格式内容。-format_output 让primer3_core产生人类易读的结果，否则产生机器易读的结果（Boulder-IO格式结果）。-strict_tags 要求输入文件中的标签要全部正确。设置该参数后，如果有标签不能被程序识别，则报错并停止执行。不设置此参数，则软件忽略不识别的参数。-p3_settings_file=file_path 指定 primer_core 的配置文件，该配置文件的设定会取代默认设置。当然，-echo_settings_file 打印出p3_settings_file中的设置信息。如果没有指定设置文件，或含有-format_output，则该参数失效。-output=file_path 指定输出文件路径，如果不指定，则输出到标准输出。-error=file_path 指定错误信息输出路径，如果不指定，则输出到stderr中。

Primer3使用的难点是根据自身需求准备p3_settings_file文件。我的一个示例如下（使用时需要去掉#注释部分和空行，且必须第三行留空行）：

编写程序primer3_with_ePCR_validation.pl，输入模板序列的FASTA文件，即可对所有的模板序列批量化进行引物设计。若同时输入全基因组的序列，进一步可以对设计出的引物进行特异性筛选。