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以前的研究发现胸腺和脾脏是体内辐射敏感组织，而肝脏不是。胸腺和脾脏在体内全身辐射后会触发p53依赖性凋亡，但这种肝脏特异性抗性的分子机制尚不清楚。

2023年03月28日，美国西奈山伊坎医学院James J. Manfredi团队通过对经辐射处理的小鼠器官进行联合RNA测序（RNA-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，鉴定出共有的和组织特异性p53转录反应，揭示了胸腺和脾脏共有的p53靶点富含凋亡靶点。且肝脏不能上调这些基因并不是因为基因占有率降低。小鼠模型实验表明，p53的C末端缺失可导致肝内p53凋亡靶点的辐射诱导表达，并伴随细胞死亡增加。全面的RNA-seq分析显示，C末端在肝脏特异性p53靶点的转录激活中需要发挥额外作用。作者推测，抑制凋亡基因表达和增强肝脏特异性靶点激活都会导致组织特异性放射抵抗。相关研究成果以“In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity”为题发表在《Cell Reports》期刊（IF 8.8）。

研究要点：

RNA-seq和ChIP-seq显示p53辐射反应具有共有性和组织特异性

肝脏p53靶向凋亡靶基因，但不能调控其表达

p53C末端抑制肝细胞凋亡基因，具有放射抗性

p53C末端是肝脏特异性基因对辐射反应所必需的

材料方法：

样本处理：对21日龄不同基因型C57/Bl6小鼠进行2Gy精密X射线照射。X光照射的小鼠和年龄匹配的未受照射的对照小鼠在笼中保持3h。称重21日龄不同基因型C57/Bl6小鼠，在PBS（10μg/g体重）或PBS中腹腔注射100μl阿霉素。

方法：RNA提取、qRT-PCR、RNA-seq、ChIP-seq、TUNEL（通过标记核酸末端检测DNA片段）、免疫印迹。

研究结果：

（1）DNA损伤诱导小鼠胸腺和脾脏的p53依赖性细胞凋亡，但不诱导肝脏凋亡

图1：DNA 损伤在胸腺和脾脏中诱导 p53 依赖性细胞凋亡，但不诱导肝脏凋亡，具有共有和组织特异性的 p53 转录反应

图1A：对野生型C57/BL6小鼠进行2Gy的X射线照射6h，胸腺和脾脏出现大量的凋亡，而肝脏则没有。

图1B：使用p53基因缺失的小鼠进行同样处理，证明胸腺和脾脏的这些效应确实是p53依赖性的。

图1C：WB实验确定三种组织中p53的相对表达水平。照射3h后，p53在三种组织中的表达被诱导，6h后减弱。

图1D：定量测量p53和actin条带的相对强度表明，这三种组织中p53的表达水平没有差异。然而，肝脏显示出强大的p53靶基因反应

图1E/F：野生型和p53缺失小鼠均未接受或接受2 Gy的X射线照射，进行RNA-seq分析。

图1G：对相应组织进行ChIP-seq分析，以确定p53的占据位点。

图1H/I：整合RNA-seq与ChIP-seq数据，挖掘表达水平显著改变同时也有相关peak的基因，以鉴定真正的p53靶点。

（2）X射线诱导p53直接转录靶标的共同核心集

图2：X辐射诱导一组共有的p53直接转录靶标核心

图2A/B：图1H发现，20个基因在三种组织中均显著上调，且在基因的10 kb范围内至少有一个peak。这20个基因的上调在所有受检组织中都依赖于p53。

图2C：选择了三个基因进行qRT-PCR验证。Ccng1、Phlda3和Aen都上调了3-12倍，前两个基因在每个组织中都明显依赖于p53。

图2D：在靠近转录起始位点的地方存在稳健的峰，且在Phlda3中，在基因上游存在额外的峰。

图2E：对所有20个共有基因的motif分析确定了一个的非常相似的motif。

图2F：这些peak大部分位于p53本身或p53的上游，只有少数位于下游。

图2G：GSEA显示，GO_BP与先前与导致细胞凋亡的p53 DNA损伤应答相关的基因有关

（3）肝脏 p53 无法上调凋亡基因

图3：肝脏p53无法上调凋亡基因

图3A：为阐明胸腺和脾脏与肝脏对辐射的不同生物反应的基础，确定了敏感组织中特异性上调的基因。结果发现，80个基因在胸腺和脾脏中的表达在辐射后增加，而在肝脏中没有变化。所有这80个基因都有与之相关的ChIP峰，并被认为是p53的真正靶标。

图3B：GSEA显示与细胞凋亡相关的生物过程是富集率最高的。

图3C：与凋亡过程基因集重叠的21个基因被证实其基因表达依赖于p53，并且在肝脏中不表达。

图3D：qRT-PCR证实这些基因的一个子集（Bbc3、Pmaip1和Bax）在胸腺和脾脏中确实是选择性靶点，但在肝脏中不是，并且它们的表达依赖于p53。一个共同的靶点Cdkn1a在所有三个组织中作为p53依赖性基因表达的阳性对照。在10周龄小鼠中检测Bbc3 (Puma)时，在蛋白和mRNA水平发现了类似的组织特异性。这就提出了一种可能性，即基因表达的组织特异性可能与对X射线的不同敏感性有关。

（4）无法上调肝脏中的p53凋亡靶点不是由于基因占用减少

图4：无法上调肝脏中的p53凋亡靶点不是由于基因占用减少

图4A：肝脏p53不能上调凋亡靶点的分子基础可能是由于基因占据受损或DNA结合后。为解决这个问题，作者研究了三个关键凋亡靶标（Bbc3、Pmaip1和Bax）的ChIP-seq图谱。在照射胸腺和脾脏中，三个基因都观察到强大的p53峰值。在肝脏中，这三个基因的p53占据率也相似

图4B：为了验证这一发现，野生型p53小鼠体内用另一种DNA损伤剂多柔比星处理，并对肝脏和脾脏组织进行分析。进行qRT-PCR检测两个共享靶标Cdkn1a和Mdm2的mRNA水平，并与两个凋亡靶标Bbc3和Pmaip1进行比较。与X-射线照射后的结果一致，多柔比星处理导致肝脏和脾脏中Cdkn1a和Mdm2的增加，而Bbc3和Pmaip1仅在脾脏中被诱导。

图4C：对相应的肝脏和脾脏组织样本进行染色质免疫沉淀。与X-射线的结果一样，多柔比星处理后，在肝脏和脾脏的Cdkn1a、Bbc3和Mdm2基因的反应元件上检测到p53的占据，Alb基因的一个区域被用作阴性对照

（5）肝脏p53靶基因表达缺陷有两种机制

图5：肝脏p53靶基因表达缺陷有两种机制

图5A：然后研究了80个胸腺和脾脏靶点中有多少具有类似的特性，即它们也被p53占据但在肝脏中不被上调。

图5B：与胸腺和脾脏相比，这些基因在肝脏中的占据率在统计学上更高。两个代表性基因（Notch1, Ei24）的ChIP-seq图谱显示，p53在所有三个组织中都有很强的占据率。80个基因中有74个被肝脏p53占据，其中所有与GO凋亡过程基因组重叠的基因都在这里被发现。这些峰值主要出现在上游区域。将这些峰中的p53 motif进行比对，发现它们与之前确定的p53共识有合理的匹配。

图5C：其余6个基因在肝脏中没有与之相关的稳健的p53 ChIP峰。展示了ChIP-seq图谱的两个例子（Hgfac和Dcaf4）。在胸腺和脾脏中发现的这些峰值，但在肝脏中没有发现，这些峰也大多出现在基因体内。这些峰中的p53 motif也与p53共识相似。

（6）p53的C末端阻止肝脏中p53细胞凋亡靶标的上调

图6：内源性Trp53基因表达了一个缺少最后24个氨基酸的截短蛋白。对p53Δ24/-小鼠进行X-射线处理并分析p53靶点的表达。与p53+/-小鼠相比，Δ24/-小鼠肝脏、胸腺和脾脏中某些p53靶点的表达进行了检测。

图6A：CTD的缺失对胸腺/脾脏中共有靶点Cdkn1a和Mdm2或胸腺/脾脏特异靶点Bbc3、Pmaip1和Bax的基因表达没有实质性影响。相反缺失CTD后，肝脏中Cdkn1a、Bbc3、Pmaip1和Mdm2的诱导作用增强，但Bax的诱导作用不增强。

图6B：辐射后p53+/-肝脏中mRNA几乎没有变化的Bbc3，在p53Δ24/-肝脏中被辐射诱导。

图6C：WB以确定CTD的缺失是否改变了p53蛋白的表达。多个蛋白定量证实不同组织的p53水平相当。p53蛋白水平的诱导在不同组织和基因型中同样相似。与p53Δ24/-肝脏中Bbc3 mRNA的诱导一致，Puma蛋白也被强有力地诱导，并具有统计学意义（图6B和6C）。因此，CTD的缺失允许肝脏特异性上调凋亡靶标，特别是在辐射处理后的Bbc3。

（7）p53的C端阻止X射线诱导的肝脏凋亡

图7：p53的C末端可防止X射线诱导的肝脏细胞凋亡，并确定肝脏特异性基因表达

图7A：为观察CTD缺失后观察到的基因表达变化是否会影响X射线治疗后的生物学结果，对p53+/-和p53Δ24/-小鼠的肝组织进行了TUNEL检测。显微照片证实p53+/-肝脏在辐射前后几乎没有TUNEL阳性。相反，p53Δ24/-肝脏显示TUNEL阳性细胞增加。

图7A右：对多个实验中的此类显微照片进行定量显示增加了7倍，这与CTD缺失增强肝脏辐射敏感性的观点一致。

图7L/M：GSEA显示，这两组基因（CTD需要表达的基因和CTD抑制表达的基因）具有不同的生物学过程。

关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

应用方向：

ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位

转录因子和辅因子结合作用

复制因子和 DNA 修复蛋白

组蛋白修饰和变异组蛋白

技术优势：

物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；

微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；

方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。

技术路线：

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.

参考文献：

Resnick-Silverman L, Zhou R, Campbell MJ, Leibling I, Parsons R, Manfredi JJ. In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112216. pii: S2211-1247(23)00227-9. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112216. PubMed PMID: 36924496.