本发明属于基因工程技术领域，具体涉及本发明涉及一种玉米抗盐主效qtl及其相关基因、分子标记和应用。

背景技术：

盐碱胁迫是自然界中分布较广、对农业生产影响较大的非生物胁迫，它给农业生产造成的损失仅次于干旱。近年来，全球盐碱化进程的加快进一步加重了盐碱对农业生产的威胁。根据联合国教科文组织和粮农组织的不完全统计，全世界盐碱地面积为9.5×109hm2，其中10％左右为耕地。我国有10.0×107hm2盐碱地，其中20％左右为耕地。(zhangjf，2004)。我国北方地区耕地盐碱危害较南方更严重，并且在自然条件(如降雨少)和人为因素(如灌溉依赖的耕作)的共同作用下，北方地区耕地盐碱化问题正在进一步加剧。例如，吉林省西部地区是我国土地盐碱化的重灾区，该地区盐碱化土地面积已占该地区国土总面积的30.80％，并且正在以每年＞1.0％的增速增长，这势必威胁到粮食生产和粮食安全。因此，在粮食需求日益增长的大背景下，合理应对盐碱胁迫对农业生产(尤其是主要作物生产)的负面影响，对维持我国农业生产的可持续发展有重要意义。

玉米对盐胁迫十分敏感(王丽燕，2005)，已有研究表明不同玉米自交系的抗盐能力存在显著差异，普遍认为这种差异是多种抗盐生理性状的综合体现，是多基因控制的数量性状(fooladandjones，1993)。在此基础上，已有一些研究尝试通过转录组分析、蛋白质组分析及qtl分析来发掘相关基因(zhangetal.,2015；cuietal.,2015)，但大多研究都止步于初步定位或候选基因，到目前为止还没有玉米抗盐qtl被精细定位或克隆，这已然成为玉米抗盐分子标记开发和抗盐玉米培育的主要瓶颈。因此，抗盐玉米培育的重要任务之一是克隆抗盐qtl基因，研究其介导抗盐的分子机制，开发用于抗盐玉米培育的分子标记。

当植物生长在盐胁迫条件下时，根系会吸收过量的na+，同时k+吸收受阻，导致组织中k+/na+比率失衡，最终导致离子毒害，因此维持na+、k+浓度的稳态及k+/na+比率平衡在植物抗盐能力形成过程中发挥着至关重要的作用(zhuetal.,2002；munnsandtester,2008；jiangetal.,2012)。在玉米中的研究表明，当生长在盐胁迫条件下，不同玉米自交系叶片中积累的na+浓度以及k+/na+比率存在显著差异(zhaoetal.,2010；chenetal.,2016)，但到目前为止还没有相关qtl基因被精细定位/克隆，因此克隆调控玉米na+、k+浓度以及k+/na+比率的qtl基因是当前玉米抗盐机制研究的重要任务。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种玉米抗盐qtl基因，所述基因其编码核苷酸序列选自：

(a)seqidno.1所示的序列；

(b)seqidno.1所示的序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

同时，本发明还提供了上述玉米抗盐qtl基因所编码的蛋白质。

上述蛋白质，优选地，其氨基酸序列如序列表中seqidno.2所示。

对于上述玉米抗盐qtl基因，本发明的发明人发现郑丹958的两个亲本自交系郑58和昌7-2的抗盐性存在显著差异，以郑58/昌7-2ril群体为材料，本发明利用qtl分析及其它生物信息学手段，克隆了玉米抗盐qtl基因，命名为zmnc1，该基因编码区长度为1593bp(详细序列见seqidno.1)，编码530个氨基酸(详细序列见seqidno.2)。

本发明的目的也在于提供一种玉米抗盐主效qtl，其特征在于，该主效qtl位于3号染色体55,028-55030kb的位置。

为了筛选适合抗盐分子标记的dna序列变异，发明人对抗盐自交系郑58和盐敏感自交系昌7-2基因组dna进行了重测序，通过数据分析和基于pcr产物的测序验证，鉴定到一个抗感材料间存在差异的390bp(具体序列见seqidno.3)插入片段，将该插入片段命名为zmnc1-indel。该插入仅存在于盐敏感材料昌7-2中，导致zmnc1读码框移码和翻译的提前终止，适合用于分子标记。

本发明的目的也在于提供一种玉米抗盐相关的分子标记，所述分子标记表现为seqidno.3所示核苷酸序列在上述抗盐qtl基因中插入或缺失。

上述分子标记，进一步地，表现为seqidno.3所示核苷酸序列在所述抗盐qtl基因中的第二外显子中插入或缺失。

上述分子标记，进一步地，在所述抗盐qtl基因中插入seqidno.3所示核苷酸序列的个体为盐敏感型；所述抗盐qtl基因缺失seqidno.3所示核苷酸序列的个体为抗盐型。

同时，本发明还提供了用于检测权利上述分子标记的引物对，包括：引物对ⅰ和引物对ⅱ，所述引物对ⅰ为引物zmnc1-f1和引物zmnc1-r1，所述引物对ⅱ为引物zmnc1-indel-f1和引物zmnc1-r1；

所述引物zmnc1-f1、zmnc1-indel-f1和zmnc1-r1序列如下：

引物zmnc1-f1：tacctgcacacatcgatcga；

引物zmnc1-indel-f1：ccagaacacaccaggaacca；

引物zmnc1-r1：tcaggttgatcgagcgagtt。

利用上述引物对，以所述待测玉米基因组dna为模板进行pcr扩增，如果用引物对ⅰ扩增后得到777bp的片段，用引物对ⅱ扩增后没有片段，则为抗盐型；如果用引物对ⅰ扩增后没有片段，用引物对ⅱ扩增后得到743bp的片段，则为盐敏感型。

同时，本发明还提供了一种用于检测上述分子标记的试剂盒，包括上述的引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括用于pcr扩增的酶和试剂，用利用上述引物对进行pcr扩增。

本发明的目的还在于提供一种检测玉米是否抗盐的方法，包括：

对待测玉米进行上述分子标记的检测，根据检测结果判断其是否抗盐。

上述方法中，所述方法包括：

利用上述引物对，或者上述试剂盒，以所述待测玉米基因组dna为模板进行pcr扩增；

根据扩增结果判断是否抗盐：如果用引物对ⅰ扩增后得到777bp的片段，用引物对ⅱ扩增后没有片段，则为抗盐型；如果用引物对ⅰ扩增后没有片段，用引物对ⅱ扩增后得到743bp的片段，则为盐敏感型。

上述抗盐qtl基因、上述蛋白质、上述主效qtl、上述述的分子标记、上述引物对，上述试剂盒在玉米抗盐育种中的应用。

本发明的有益效果

(1)本发明提供了一种新的玉米抗盐主效qtl，及其相关的抗盐qtl基因的核苷酸序列和其对应的蛋白质氨基酸序列，并且在此抗盐qtl基因内，鉴定了一个位于在其外显子中插入或缺失的，与玉米抗盐性连锁的大片段，该片段的插入或缺失，可作为玉米抗盐分子标记。本发明还提供了一种用于检测本发明的玉米抗盐分子标记的引物对和试剂盒，以及检测玉米是否抗盐的方法。

(2)由于玉米抗盐属数量性状遗传，表型分析耗时费力，上述的玉米抗盐主效qtl、抗盐qtl基因及其蛋白质、分子标记、引物对和试剂盒都可以应用于玉米抗盐育种中，在玉米种子期间或子叶长出的早期阶段就可鉴定，省时而且准确，可以加速玉米抗盐品种选育进程。

附图说明

图1为郑58和昌7-2在对照和盐胁迫条件下生长8周的对比结果；其中(a)为郑58和昌7-2在对照和盐胁迫条件下生长8周的植株生长状况；(b)a图中各植株第三片叶的放大图；其中标尺大小为15cm。

图2为抗盐qtl基因zmnc1的定位及遗传验证；其中(a)为基于郑58/昌7-2ril群体的qtl分析确定的抗盐主效qtl，及其相关基因zmnc1的位置；(b)为转录组测序比较zmnc1基因在郑58和昌7-2中的表达水平；(c)为利用crspr-cas9敲除后的基因和原基因序列的比较；(d)为pbue411-zmnc1载体结构示意图；(e)为在对照或盐处理条件下生长了7周的野生型和zmnc1基因敲除植株(zmnc1crispr-1，zmnc1crispr-2)的生长情况；其中标尺大小为15cm。

图3为zmnc1基因的结构示意图。

图4为zmnc1基因全长编码序列pcr扩增的电泳图；其中1为以来自郑58幼苗的cdna为模板，用zmnc1特异的引物(zmnc-gene-f和zmnc-gene-r)进行扩增获得的pcr产物(预期产物大小1593bp)，m为天根公司分子量标准500bpmarker。

图5为zmnc1基因编码序列连接入t载体后的载体图谱。

图6为zmnc1编码的蛋白定位在细胞膜并具有na+转运活性；其中(a)为pcambiasuper1300-gfp-zmnc1载体结构示意图；(b)为在烟草表皮细胞中分析zmnc1-gfp亚细胞定位；(c)为pgemhe-zmnc1载体结构示意图；(d)为在爪蟾卵母细胞中分析zmnc1编码蛋白的na+转运活性。

图7为抗感材料间(郑58和昌7-2间)存在差异的390bp核苷酸序列的鉴定及其对zmnc1读码框的影响；其中(a)为昌7-2中鉴定到的大片段插入zmnc1-indel的插入位置(图中箭头所示)及用于扩增插入片段的引物zmnc1-f1，zmnc1-r1，zmnc1-indel-f1，zmnc1-r1的位置；(b)为郑58和昌7-2zmnc1编码的蛋白序列比较。

图8为利用两对引物(引物对ⅰ和引物对ⅱ)在郑58和昌7-2中进行pcr扩增的结果；其中，m为天根公司分子量标准500bpmarker。

图9为抗盐基因型玉米自交系(有zmnc1-indel插入)和盐敏感基因型玉米自交系(没有zmnc1-indel插入)叶片中na+含量比较结果。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1玉米抗盐qtl基因的克隆及功能分析

郑丹958的两个亲本自交系郑58和昌7-2的抗盐性存在显著差异，如图1所示。以郑58/昌7-2ril群体为材料，本发明通过基于混合线性模型的qtl分析在3号染色体上定位了一个主效抗盐qtl区域，如图2a所示，在3号染色体上55,028-55030kb的位置，位置根据玉米b73参考基因组v2确定。在此基础上通过转录组测序比较对照及盐胁迫下郑58和昌7-2的转录组，在此qtl候选区域鉴定到一个候选基因，命名为zmnc1，其表达水平在昌7-2中显著低于郑58，如图2b所示，结果表明，在对照和盐处理条件下，昌7-2中该候选基因的表达水平都显著低于郑58。

为了获得zmnc1的突变体，发明人(1)设计了crspr-cas9敲除靶点，如图2c所示；(2)用bsai对含有靶点序列的pcr片段和pbue411载体进行酶切、连接，连接产物转入大肠杆菌，用通用引物fd3/rd进行菌落pcr扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性克隆，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得正确的pbue411-zmnc1载体(图2d),将pbue411-zmnc1转入农杆菌eha105；(3)通过幼胚侵染的方法获得转基因植株；(4)通过对包括靶点在内的基因片段进行pcr扩增、测序确定转基因阳性植株。最终获得了两个zmnc1候选基因的敲除材料(命名为zmnc1crispr-1和zmnc1crispr-2)，并证明这两个突变体跟昌7-2一样表现出盐敏感的表型，如图2e所示，表明zmnc1基因敲除植株对盐胁迫更敏感，表现为叶片黄化，说明该基因的确是抗盐qtl基因zmnc1。

基于maizegdb网站对zmnc1基因结构的预测，基因全长(从起始密码子到终止密码子)1905bp，包含三个外显子，两个内含子，其中编码区序列全长1593bp，如图3所示。为了克隆zmnc1全长编码序列，以生长10天的抗盐玉米自交系郑58幼苗为材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物总rna提取试剂盒(cat.#dp432)提取总rna，并通过使用普洛麦格(北京)生物技术有限公司的m-mlv反转录酶进行反转录获得cdna，用zmnc1特异的引物(正向引物zmnc-gene-fatgccccctttgcacgtcccc；反向引物zmnc-gene-rtcagttcagcctccatgcctg)进行pcr扩增，获得了与预期大小(1593bp)相符的产物，如图4所示。pcr扩增体系为50μl，包括：2×supermultiplexpcrmix25μl；10μmprimerzmnc-gene-f2μl；10μmprimerzmnc-gene-r2μl；dna1μl,ddh2o20μl)。pcr扩增条件为：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃1min,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。

使用天根生化科技(北京)有限公司的凝胶回收试剂盒(cat.#dp105-3)对pcr产物进行回收和纯化，用北京全式金生物技术有限公司的peasy-bluntcloningkit试剂盒对纯化后的产物进行t载体的连接(载体图谱见图5)，然后转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，使用通用引物t7/sp6进行菌落pcr扩增，电泳检测有目的大小条带的菌落为阳性重组体，将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得了1593bp的zmnc1外显子序列，其核苷酸序列见seqidno.1，对应的蛋白质的序列为seqidno.2所示。

生物信息预测zmnc1编码一个na+转运蛋白，通过(1)用xbai和hindiii对含有xbai和hindiii酶切位点的zmnc1片段和pcambiasuper1300-gfp载体进行双酶切，酶切片段通过t4连接酶连接，转入大肠杆菌，通过菌落pcr扩增筛选有目的条带的阳性克隆；(2)将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，最终获得正确的pcambiasuper1300-gfp-zmnc1(图谱如图6a所示)；(3)将pcambiasuper1300-gfp-zmnc1转入农杆菌gv3101，挑单克隆接种到3mlyeb液体培养基(含抗生素)在200rpm，28℃摇床培养过夜；(4)将上述过夜培养菌液在常温，4000rpm下离心2min，收集菌体；(5)用渗透培养液(10mmolmgcl2)重新悬浮沉淀的农杆菌细胞，调节浓度od600至0.5～1.0；(6)用1ml的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内；(7)注射过的烟草继续生长2-3天(8)使用激光共聚焦显微镜观察叶背面荧光表达情况。结果如图6b所示，zmnc1-gfp定位在质膜上。

与此同时，通过爪蟾卵母细胞中实验系统确定zmnc1具有内向转运na+的活性。具体实验流程为：(1)用xbai和hindiii对含有xbai和hindiii酶切位点的zmnc1回收片段和pgemhe载体进行双酶切，酶切片段通过t4连接酶连接，转入大肠杆菌，通过菌落pcr扩增筛选有目的条带的阳性克隆；(2)将对应的菌液送至北京三博远志生物技术有限责任公司测序，最终获得正确的

pgemhe-zmnc1(图谱如图6c所示)；(3)通过promega公司的试剂盒反转录获得zmnc1的crna；(4)25nl(0.5μgμl-1)的zmnc1crna和等体积的水分别注射到爪蟾卵母细胞中；(5)培养36小时后通过电压钳记录不同na+浓度条件下爪蟾卵母细胞内的电流。如图6d所示，注入zmnc1crna的爪蟾卵母细胞可以记到明显的电流，随着记录液中na+浓度的改变，记录到的逆转电位会发生显著改变。实验所用的记录电压为-140-40mv。表明抗盐基因zmnc1编码一个内向na+转运蛋白，它可能通过调控盐胁迫下植物对na+的吸收来调控植物抗盐。

实施例2玉米抗盐qtl基因zmnc1外显子中插入的大片段(zmnc1-indel)的获得

利用illumina测序平台对郑58和昌7-2的基因组dna进行测序(测序在北京诺禾致源科技股份有限公司完成)，通过比对郑58和昌7-2的全基因组测序数据，发现在盐敏感自交系昌7-2中，zmnc1基因的第二个外显子有一个大片段插入，命名为zmnc1-indel，如图7a所示。根据全基因组测序数据，发明人设计了两对引物zmnc1-f1/zmnc1-indel-r1和zmnc1-indel-f1/zmnc1-r1(引物在基因上的具体位置如图7a所示)。引物序列为：

zmnc1-f1：tacctgcacacatcgatcga；

zmnc1-indel-r1：caacaggaaatgggctggac；

zmnc1-indel-f1：ccagaacacaccaggaacca；

zmnc1-r1：tcaggttgatcgagcgagtt。

以zmnc1-f1/zmnc1-indel-r1和zmnc1-indel-f1/zmnc1-r1为引物，以昌7-2的基因组dna为模板，使用康为世纪生物技术有限公司的taqdna聚合酶进行扩增(pcr体系50μl：2×supermultiplexpcrmix25μl,10μmprimerzmnc1-f12.5μl,10μmprimerzmnc1-r1/zmnc1-indel-r12.5μl,dna2.0μl,ddh2o18μl；pcr程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min)，将pcr产物送到北京三博远志生物技术有限责任公司测序，获得测序结构后，通过codoncodealigner软件拼接，获得了zmnc1-indel插入序列的长度为390bp，该插入导致昌7-2的zmnc1读码框移码和翻译的提前终止，如图7b所示，较浅颜色序列为zmnc1-indel插入导致昌7-2中zmnc1读码框移码的情况，zmnc1-indel插入的具体序列如seqidno.3所示。

实施例3玉米抗盐基因zmnc1中的zmnc1-indel插入或缺失作为分子标记

因为zmnc1-indel插入仅存在于盐敏感玉米自交系昌7-2中，它导致抗盐基因zmnc1读码框移码和翻译的提前终止，因此zmnc1-indel插入可以用于判断个体是否抗盐的分子标记。

利用基于zmnc1-indel插入的侧翼序列设计的引物zmnc1-f1(正向)和zmnc1-r1(反向),以及基于zmnc1-indel插入序列设计的引物zmnc1-indel-r1(反向)，以上述三条引物组成引物对ⅰ(zmnc1-f1/zmnc1-r1)和引物对ⅱ(zmnc1-f1/zmnc1-indel-r1)。以引物对ⅰ和ⅱ为引物，分别以抗盐玉米自交系郑58和盐敏感玉米自交系昌7-2的基因组dna为模板，进行pcr扩增。pcr体系20μl：2×supermultiplexpcrmix10μl,10μmprimerzmnc1-f11μl,10μmprimerzmnc1-r1/zmnc1-indel-r11μl,dna1μl,ddh2o7μl。pcr程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。结果发现以玉米抗盐自交系郑58总dna为模板进行pcr扩增，引物对ⅰ可获得777bp的条带(详细序列见seqidno.4)，引物对ⅱ没有条带；以玉米盐敏感自交系昌7-2总dna为模板进行pcr扩增，引物对ⅰ没有条带，引物对ⅱ可获得743bp的条带(详细序列见seqidno.5)，如图8所示。因此，以引物对ⅰ和ⅱ可以用于玉米抗盐分子辅助育种，把基于引物对ⅰ和ⅱ的抗盐分子标记命名为zmsalt1。其中各引物的序列为：

zmnc1-f1：tacctgcacacatcgatcga；

zmnc1-indel-f1：ccagaacacaccaggaacca；

zmnc1-r1：tcaggttgatcgagcgagtt。

实施例4利用抗盐分子标记检测玉米是否抗盐

选取了24种玉米自交系材料(包括一些玉米骨干自交系)进行检测，检测方法如实施例3所述，利用实施例3中的检测本发明抗盐分子标记的引物对，以所述待测玉米基因组dna为模板进行pcr扩增。其结果表明：其中14分自交系引物对ⅰ有pcr产物，产物长度为777bp，引物ⅱ对无pcr产物，为抗盐基因型，另外10分自交系引物对ⅰ无pcr产物，引物ⅱ对有pcr产物，产物长度为743bp，为盐敏感基因型基因型。所用自交系名称和鉴定结果如下表所示：

“√”表示pcr产物有条带；“×”表示pcr产物无条带。

在盐胁迫条件下，盐敏感基因型材料(有zmnc1-indel插入)叶片中的na+含量显著高于抗盐基因型材料(无zmnc1-indel插入)，相关检测结果如图9所示，与抗盐分子标记zmsalt1的鉴定结果一致。

序列表

;110;中国农业大学

;120;一种玉米抗盐主效qtl及其相关基因、分子标记和应用

;130;seqlist

;160;4

;170;siposequencelisting1.0

;210;1

;211;1593

;212;dna

;213;zeamays

;400;1

atgccccctttgcacgtccccggtagtagtactcctcgcaagttctatcacctggtgctg60

ttccatgtgcacccgttctggatccaagtcctgtacttccttttgatctccgttttgggt120

ttcttgatgctgagagtcctgcccatgaagtccagctccgtgcctaggccctcggctctg180

gacctactcttcacgtcggtgtcggcgacgacagtctccagcatgatcgccgtcgagatg240

gaatccttctctaacgcgcagctcctcctcatgaccctccttatgctcctcgggggcgag300

gtgttcacaagcatgcttggtctccacttcacctgcaccaagctcagaaacaagagagaa360

acacctcataataatctccatggtaatagcttagagcagagtcgtcgtcgtcaccgtccc420

atggagatggaagcccaggccgccgccgtccaaatggagcttgcagggttcaacaaggac480

ggccatggcgatttcgcatccatggctaggttgctaatgtttatcgtgctgggctacatc540

ttggtcgtgcacatcgccggctacgcgctcattctaatctaccttagcgtggtcggcagc600

gcgagagcagtgcttgttaggaagaggatcagcctgagcaccttctccgtcttcacggtc660

gtctcgtcgttcgcaaactgtggcttcgtgccaaccaacgaggggatggtgtccttcaag720

tccttcccgggcatgctcctcctggtcatgccacacatcctgctcgggaacacgctcttc780

cccatcttcctcaggctctccattacggcgctcgagagggtcacaaggtggcgagacctc840

tgcgagctgctgagagacagaggacccggcggcgggccagctgcggctgccgccgccgcc900

gctataggctacgaccacctgctcccgggaccgcgcacatggttccttgctctcaccgtg960

gcggtgttcctggcggtgcagctggtgctctactgcgccatggagtggggctccggtggc1020

cttggagggctcaacgcgttccagaagctcgttgcagcggtcttcatgtccgtcaactcc1080

aggcactccggcgagatggtcgtcgacctcggcaccgtctcgtccgccgtcgtcgtgatg1140

tatgtgctcatgatgtatctaccgccttacactacatttttacccgtagcagtggaagat1200

gaccagcagctacaaaatgaggcacaaccccacgacaatagcagcagaagtattagcatc1260

tggcacaagctgctgatgtcgccgctctcgtgcctaaccatcttcatcgtcgttatctgc1320

atcaccgagaggcggcagattgctcgtgacccaatcaacttcagcgtcctcaacatcgtc1380

gtcgaggtcatcagtgcgtatggcaacgtgggattcagcaccgggtacagctgcagcagg1440

caggtgacgcccgacggcagctgcaaggacgcgtgggttagcttgtccggcaagtggagt1500

gtggaagggaagctcacgctcatggccatcatgttctatggcaggctcaagaagttcagc1560

atgcttgggggtcaggcatggaggctgaactga1593

;210;2

;211;530

;212;prt

;213;zeamays

;400;2

metproproleuhisvalproglyserserthrproarglysphetyr

151015

hisleuvalleuphehisvalhisprophetrpileglnvalleutyr

202530

pheleuleuileservalleuglypheleumetleuargvalleupro

354045

metlysserserservalproargproseralaleuaspleuleuphe

505560

thrservalseralathrthrvalsersermetilealavalglumet

65707580

gluserpheserasnalaglnleuleuleumetthrleuleumetleu

859095

leuglyglygluvalphethrsermetleuglyleuhisphethrcys

100105110

thrlysleuargasnlysarggluthrprohisasnasnleuhisgly

115120125

asnserleugluglnserargargarghisargprometglumetglu

130135140

alaglnalaalaalavalglnmetgluleualaglypheasnlysasp

145150155160

glyhisglyaspphealasermetalaargleuleumetpheileval

165170175

leuglytyrileleuvalvalhisilealaglytyralaleuileleu

180185190

iletyrleuservalvalglyseralaargalavalleuvalarglys

195200205

argileserleuserthrpheservalphethrvalvalserserphe

210215220

alaasncysglyphevalprothrasngluglymetvalserphelys

225230235240

serpheproglymetleuleuleuvalmetprohisileleuleugly

245250255

asnthrleupheproilepheleuargleuserilethralaleuglu

260265270

argvalthrargtrpargaspleucysgluleuleuargasparggly

275280285

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290295300

asphisleuleuproglyproargthrtrppheleualaleuthrval

305310315320

alavalpheleualavalglnleuvalleutyrcysalametglutrp

325330335

glyserglyglyleuglyglyleuasnalapheglnlysleuvalala

340345350

alavalphemetservalasnserarghisserglyglumetvalval

355360365

aspleuglythrvalserseralavalvalvalmettyrvalleumet

370375380

mettyrleuproprotyrthrthrpheleuprovalalavalgluasp

385390395400

aspglnglnleuglnasnglualaglnprohisaspasnserserarg

405410415

serileseriletrphislysleuleumetserproleusercysleu

420425430

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