申请/专利权人：中国辐射防护研究院

申请日：2013-12-31

公开（公告）日：2018-07-06

公开（公告）号：CN104745580B

主分类号：C12N15/113(2010.01)I

分类号：C12N15/113(2010.01)I;C12N15/867(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N5/10(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2015.07.01#公开;2016.10.26#实质审查的生效;2018.07.06#授权

摘要：本发明涉及沉默人的CDT1基因的siRNA，其具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的任一序列。本发明还提供了含上述沉默人的CDT1基因的siRNA重组载体以及含上述沉默人的CDT1基因的siRNA、重组载体的用途。本发明提供的沉默人的CDT1基因的siRNA、重组载体可为人的CDT1基因功能的研究提供有效技术工具。

主权项：1.沉默人的CDT1基因的siRNA，其特征在于，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的任一序列。

全文数据：沉默人的CDT1基因的siRNA、重组载体及用途技术领域[0001]本发明属于分子生物学和生物制药技术领域，具体涉及沉默人的CDTl基因的siRNA、重组载体及用途。背景技术[0002]RNAi是一种转录后基因沉默机制，它通过双链RNAdsRNA引起序列同源的mRNA降解，来降低目标基因的表达，这个现象在进化过程中保守而且广泛。目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域，成为了一种主要的生物学研究工具，为分析基因功能和信号传导通路以及基因治疗提供了一种新的研究手段，于2006年获得诺贝尔奖。RNAi具有以下特征优势：1.作用的特异性，只对与其同源的mRNA产生抑制作用，碱基错配会大大降低抑制效率;2.RNAi具有高度有效性，相对少量的siRNA就可以几乎完全抑制靶基因的表达。在活体细胞中输送“小干扰RNAsiRNA”的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆入质粒载体。当送入细胞体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个双链RNAshRNA，并被RNAi通道处理，之后结合到RNA诱导沉默复合物RNA-inducedsilencingcomplex，RISC，这种复合物能够结合并切割与siRNA序列匹配的mRNA，导致mRNA无法翻译成相应蛋白质，最终沉默细胞中相应蛋白的表达。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间为茎环（loop序列，反向重复序列与茎环序列形成一发夹结构。[0003]⑶Tl基因定位于16号染色体长臂，有10个外显子，编码65kDa蛋白质，包含有546个氨基酸，它参与细胞周期的调控，是一种重要的细胞周期相关因子。细胞周期由四个不同阶段组成:G1期Gapl，S期（DNA合成），M期（有丝分裂），以及G2期Gap2XDTl能够在Gl期结合染色体，募集其它信号分子形成复制前体Pre-RC，启动DNA复制，复制开始后又从染色体上脱落下来并失活，直到下一个Gl期到来，是DNA复制起始必不可少的成分。研究表明，CDTl活性的调节对于维持基因组稳定性具有非常重要的作用，CDTl的调控失常将导致细胞周期的紊乱。[0004]研究人员发现，CDT1数量异常的细胞，比如癌细胞，会出现复制和有丝分裂双重问题，CDTl的高表达在裂殖酵母和人类细胞中刺激细胞重复复制，在H1299肺癌细胞中，CDTl的过度表达足以造成在同一个细胞周期中细胞的多次复制。CDTl还可能与癌症的形成相关，其在多种癌细胞中尚表达，该基因与癌症的关系有待进一步研究。发明内容[0005]针对基因研究的需要，本发明的一个目的是提供一种沉默人的⑶Tl基因的siRNA。[0006]本发明的第二个目的是提供上述沉默人的⑶Tl基因的siRNA的用途。[0007]本发明的第三个目的是提供一种沉默人的⑶Tl基因的siRNA的重组载体。[0008]本发明的第四个目的是提供上述沉默人的⑶Tl基因的siRNA的重组载体的用途。[0009]为达到以上目的，本发明采用的技术方案是:沉默人的⑶T1基因的siRNA，具有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3的任一序列。[0010]本发明提供的沉默人的⑶T1基因的SiRNA的重组载体，含有所述的沉默人的⑶TI基因的siRNA。[0011]进一步，采用两步法构建所述重组载体，具体方法是:第一步，体外化学合成CDTl基因的siRNA表达模板单链，在退火缓冲液中退火形成双链DNA;第二步，将双链DNA克隆入表达载体，从而构建成重组载体。[0012]进一步，所述表达载体为siRNA真核表达载体Psilencer2.l-U6、pGCsi_U6NeoGFP、pGenesil-l·1或慢病毒载体pGC-LV。[0013]本发明所提供的能有效沉默人的⑶Tl基因表达的siRNA及含有该siRNA的重组载体，为人CDTl基因功能的研究提供有效技术工具。附图说明[0014]图1表示⑶T1基因mRNA水平的表达情况，其中纵坐标表示⑶T1基因mRNA水平的相对表达量，横坐标7702-NC表示对照组其中的肝细胞转染了含随机对照序列的重组质粒LV-NC-RNAi，7702-CDTlnη:1、2、3表示实验组其中的肝细胞转染了重组质粒…-⑶!！-RNAinn:l、2、3。具体实施方式[0015]以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0016]实施例1[0017]本实施例用于说明本发明提供的沉默人的⑶Tl基因的siRNA的构建方法。[0018]根据Genbank中报道的⑶T1基因的核苷酸序列，参考SiRNA设计原则设计出三条抑制⑶Tl基因表达的siRNA靶点序列，分别为SEQIDNO:1-3,同时设计随机对照序列SEQIDNO.4,如下所示：[0023]经Blast基因同源性分析，SEQIDNO:1-3序列不与任何人类非CDTl基因序列同源，以确保基因抑制的特异性。[0024]针对上述靶点序列，参考siRNA的设计策略，分别设计四对shRNAshorthairpinRNA，shRNA表达框架DNA序列（SEQIDNO.1’-3’），如下所示：[0025]SEQIDNO.1’：[0026]正义链RNAi-IF:[0027]5’-ccggCAGGACACCATCTCTGAGCTTCTCGAGAAGCTCAGAGATGGTGTCCTGTTTTTg-3’[0028]反义链RNAi-IR:[0029]5’-aattcaaaaaCAGGACACCATCTCTGAGCTTCTCGAGAAGCTCAGAGATGGTGTCCTG-3’[0030]SEQIDNO.2’：[0031]正义链RNAi-2F:[0032]5’-ccggCAGGAGGTCAGATTACCAGCTCTCGAGAGCTGGTAATCTGACCTCCTGTTTTTg-3’[0033]反义链RNAi-2I?:[0034]5’-aattcaaaaaCAGGAGGTCAGATTACCAGCTCTCGAGAGCTGGTAATCTGACCTCCTG-3’[0035]SEQIDNO.3’：[0036]正义链RNAi_3F:[0037]5’-ccggCACCTACGTCAAGCTGGACAACTCGAGTTGTCCAGCTTGACGTAGGTGTTTTTg-3’[0038]反义链RNAi-3I?:[0039]5,-aattcaaaaaCACCTACGTCAAGCTGGACAACTCGAGTTGTCCAGCTTGACGTAGGTG-3’[0040]SEQIDNO.4’：[0041]正义链（control-F:5’-ccggCATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGG[0042]AGAATGTTTTTg-3’[0043]反义链（control-R:5’-aattcaaaaaCATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACG[0044]TTCGGAGAATG-3’[0045]采用化学方法合成siRNA序列表达框SEQIDNO.1’-4’的正义链及反义链，其序列中CTCGAG为loop环序列，TTTTT为转录终止子。[0046]SEQIDNO.1’-4’在体内转录后形成以CTCGAG为loop茎环的包含SEQIDNO.1-4的siRNA发夹结构，在体内切割分别产生序列为SEQIDNO.1-3的⑶Tl的siRNAs和序列为SEQIDNO.4的对照siRNA。[0047]实施例2[0048]本实施例用于说明本发明提供的沉默人的⑶Tl基因的siRNA的重组载体的构建方法。[0049]载体采用慢病毒载体PGC-LV购自上海吉凯基因化学技术有限公司）。其框架结构为：[0050]hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin〇[0051]重组载体的构建方法如下：[0052]分别将实施例1中siRNA的4对shRNA表达框架DNA序列SEQIDNO.1’-4’的正义链及反义链在退火缓冲液（10mMTris-HCl，lmMEDTA，0.1mMNaCl90°C水浴15min，然后自然冷却至室温，反应合成双链DNAdsDNA序列，将双链DNA序列用EcoRI和AgeI酶切，同时利用EcoRI和AgeI酶切慢病毒载体pGC-LV，使其产生与双链DNA序列相同的粘性末端，利用T4DNA连接酶将双酶切线性化的慢病毒载体和DNA片段于16°C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，挑取转化子重悬于LB培养基中，取IyL作为模板，通过PCR鉴定阳性克隆。将PCR筛选鉴定的阳性克隆委托生工生物工程上海股份有限公司测序鉴定，测序结果进一步筛选重组载体。构建的重组载体可直接转染真核细胞，也可以用于慢病毒的包装。构建获得的重组载体表述为!^-^!!-!^^^!^!!:^』）。[0053]按同样方法得到含有随机对照序列的重组质粒LV-NC-RNAi，作为对照。[0054]实施例3[0055]本实施例用于说明本发明提供的沉默人的⑶Tl基因的siRNA的重组载体对人的肝细胞HL-7702的⑶Tl基因表达的抑制作用。[0056]1、细胞培养[0057]将状态良好的人正常肝细胞HL-7702接种于6孔细胞培养板中，在含20%vv小牛血清、100Uml青霉素和100mgL链霉素的RPMI1640培养基中（美国，Invitrogen公司），于37°C、5%vvCO2条件下培养，待细胞融合度达到约80%。[0058]同时，将所培养的细胞分成4组，分别为3组实验组和1组对照组。[0059]2、基因转染[0000]根据InvitrogenLipofectamine2000转染试剂说明书进行转染操作:将培养液更换成21111不含血清的1640培养基，取4.^8质粒和1^11^^^31^1^2000分别溶解于25^1无血清的1640培养基中，混勾，室温静置5min，然后将质粒-培养基、Lipofectamine2000-培养基混合液混合均匀，室温放置20min，然后将混合液加入HL-7702细胞中，37°C、5%vvCO2条件下培养12h后，换成含有新鲜20%vv血清的完全培养基，转染24h后观察荧光标记基因的表达情况来判断转染效率，转染48h后收集细胞进行荧光定量PCR检测。[0061]3、总RAN提取[0062]对应实验组和对照组的肝细胞，胰酶消化后，IOOOrpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入ImlTriolInvitrogen公司），迅速吹打后室温静置5min，然后转移至新的1.5mleppendorf管中，每管加入200μ1氯仿，用手上下颠倒15sec，室温静置10min，4°C，12000rpm，离心15min，吸取上清至新的eppendorf管中，加入等体积预冷的异丙醇，混勾后4°C沉淀lOmin，然后4°C，12000rpm离心IOmin后，去上清，加入至少lml75%vv乙醇，洗涤沉淀，4°C，IOOOOrpm离心lOmin，弃去上清，室温干燥，然后加入20μ1RNase-free水溶解。[0063]4、cDNA的制备及荧光定量PCR[0064]反转录获得cDNA的方法：利用TaKaRa公司PrimeScriptRTMasterMix试剂盒进行cDNA的制备，反应体系为10yl:5XPrimeScriptRTMasterMix2yl，RNA500ng，用RNaseFree水补足体系。反应条件为：37°C15min反转录反应），85°C15sec反转录酶的失活反应），4°C保存。[0065]焚光定量PCR:利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqIIreal-time试剂盒，实时荧光定量PCR检测CDTl基因mRNA水平的表达。CDTl基因PCR引物为:？^¥3“？^1116以5’-GCGTAGGCGTTTTGAGGAGT-3’），ReversePrimer5’-ACCTCCTGGTGCCATCCTT-3，），所选内参基因为人beta-actin基因，beta-actin基因弓I物为：ForwardPrimer5’_TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3，），ReversePrimer5，-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3，）。反应体系为25yl:SYBRPremixExTaqII2X12.5yl，ForwardPrimerIOyMIyl,ReversePrimer10μΜΙμΐ，cDNA模板2μ1，无菌水8·5ul。反应条件：95°C30secI个循环）；95°C5sec，60°〇3〇86：40个循环）。[0066]5、结果：[0067]实时焚光定量PCR米用ComparativeDelta-deltaCt法，以看家基因beta-actin为内参，相对定量CDTl基因的表达水平。计算方法为：[0068][0069]将测得的实验组和对照组的肝细胞的⑶Tl基因mRNA水平相对表达量汇总到图1上。[0070]从图1上可以看出，经转染质粒LV-CDTl-RNAinn:l、2、3肝细胞中，CDTl基因的mRNA表达水平与对照组肝细胞相比显著下降，说明本发明的⑶T1的siRNA能够高效特异性地抑制肝细胞⑶T1基因的表达。[0071]从图1上还可以看出，转染质粒LV-CDTl-RNAi3的实验组的⑶Tl基因的沉默效果最好，因此在制备沉默人的肝细胞CDTl基因的细胞模型时，可选择SEQIDNO.3为最有效的人⑶Tl基因siRNA序列。[0072]上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

权利要求：1.沉默人的⑶Tl基因的siRNA，其特征在于，其序列为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3的任一序列。2.权利要求1所述的沉默人的CDT1基因的siRNA在制备CDT1基因沉默细胞模型中的用途。3.沉默人的⑶Tl基因的SiRNA的重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的沉默人的⑶T1基因的siRNA。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，采用两步法构建所述重组载体，具体方法是:第一步，体外化学合成CDTl基因的siRNA表达模板单链，在退火缓冲液中退火形成双链DNA;第二步，将形成的双链DNA克隆入表达载体，从而构建成重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为siRNA真核表达载体Psilencer2.l-U6、pGCsi-U6NeoGFP、pGenesil-l·1或慢病毒载体pGC-LV。6.权利要求3-5任一所述的沉默人的⑶Tl基因的siRNA的重组载体在制备⑶Tl基因沉默细胞模型中的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，沉默人的CDTl基因的siRNA的重组载体在制备沉默人的肝细胞CDTl基因的细胞模型中的用途。

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