分析并定量印迹图像数据

定量凝胶或印迹是指测量目标蛋白条带发出的信号。条带信号强度与目标蛋白的浓度成正比。通过分析信号强度，可以确定样本中目标蛋白的表达量相对于其他样本（如对照组）是增加还是减少。注：蛋白免疫印迹方法是半定量的，用来显示蛋白丰度相对变化，而不是绝对定量。

蛋白条带是出现在印迹图像中的特征。印迹图像由像素组成，像素包含图像中每个位置收集的信号信息。印迹的数字图像可以看作是三维的数据。图像中的每个像素都有一个x和y坐标，此外还有一个第三维的强度值。因此，蛋白条带的定量可以被认为是定量体积，是该条带内所有像素的信号积分。.

构成条带部分的像素具有x和y坐标，因此可以勾勒出一个区域。每个像素还携带信号强度信息，可以将其视为第三维中的数据。

因此，条带的定量经常在软件中被称为“条带体积”。

没有完美的蛋白免疫印迹图像，所有印迹图像都会有一定水平的背景。该背景可能来自抗体孵育的非特异性结合、电子噪音、膜本身的荧光背景等。

从均一背景上定量条带过程相对简单。如果背景接近条带强度，或背景不均匀，那么定量条带将是具有挑战性的。图像分析软件提供背景扣除工具，具体算法取决于所使用的条带定量方法。

一个直观的类比是如何测量山的体积大小。山的高度可以使用海拔高度来度量，但是想攀登一座山，你真正感兴趣的是这座山离它的底部基础有多高。

蛋白印迹上的条带，“底部基础”是条带与膜背景相临的区域。膜背景通常高于样品托盘背景，因为膜具有一些自身固有信号，例如自发荧光。计算条带体积需要将条带中包含的所有信号累加，然后减去背景信号。​

当印迹的背景强度接近目标条带的强度时，或者背景不均匀时，将条带信号有效从背景中分离开来是具有一定挑战性的。​

印迹或图像上的背景会干扰条带信号的准确定量，影响目标蛋白的相对表达分析。图像分析软件包含一些工具，可帮助您减少背景对条带定量的影响，帮助您更好地量化目标蛋白的真实信号。注意：如果您未更改背景扣除设置，软件将自动使用默认设置，默认设置有可能是最佳的，也有可能是不合适的，取决于图像具体情况。

定量条带最直观的方法之一就是在其周围画一个方框，定量方框内的信号。在感兴趣的条带附近绘制体积框的原则是，包含条带所有强度信号，以及最少的背景信号。

使用体积工具时，请确保框住条带所有信号，不要有过多的背景区域，更不要包括相邻条带。​

使用体积工具时，有两种常用的背景扣除方法。第一种称为局部背景扣除。在局部背景扣除中，与蛋白条带直接相邻区域的像素被平均，以算出目标条带的平均背景。因此，每个体积框都会减去一个自己唯一的局部背景。每个条带周围的局部背景会不一样，所以这个局部背景是唯一的。

这种方法允许更多个性化的背景扣除，它假设前提是印迹上的背景信号会叠加给目标条带。当比较相同蛋白的多个条带时，如果其中一个位于高背景的区域，那么该条带将被扣除更多的背景。

另一种方法称为全局背景扣除。您可以绘制一个附加的区域，并将其指定为应用于整个图像的背景区域。然后从所有体积框中减去此背景体积框中的平均值。

成像软件会报告背景扣除后的体积（称为调整体积）和未扣除背景的体积（简称体积）。

从每个体积框中减去不同的背景水平。对体积框外部紧邻的像素进行平均，计算出该条带的背景水平。因此，每个体积框都有自己独特的背景水平，然后将其减去。当条带位于不同背景区域时，此方法特别有用。​

对此印迹，进行全局背景扣除并不适当，因为每个条带都位于不同水平的背景中，而局部扣除是更好的选择。​

对此印迹，进行全局背景扣除并不适当，因为每个条带都位于不同水平的背景中，而局部扣除是更好的选择。

定量蛋白免疫印迹的另一种常见方法通常称为泳道和条带工具。该方法有两步：先在图像中识别出印迹的每个泳道，然后在每个泳道内部识别出单个条带。

当您要定量每个泳道中的总蛋白或每个泳道中的多个条带时，泳道和条带工具特别有用。应当在条带的整个区域周围绘制泳道，稍微延伸到边界之外，确保包括泳道中的所有蛋白信号。绘制泳道框后，泳道轮廓也会可视化。泳道和条带工具使用不同的背景扣除方法，该方法可以轻松地对泳道中的每个条带应用局部背景扣除。

使用泳道和条带工具的第一步是定义印迹上每个泳道的轮廓。

软件可自动定义泳道，也可以手动绘制泳道框架并移动轮廓以匹配印迹上的真实泳道。

​如果泳道不平直，或者凝胶已经褶皱，软件允许弯曲各个泳道轮廓以匹配印迹上泳道的弯曲。注意捕获整个泳道，但要避免将相邻泳道包含进来。

接下来，自动识别每个泳道中的条带，也可以手动单击条带进行识别。软件可以根据用户设置的灵敏度自动检测条带。无论哪种方法，都可以添加、删除条带，或者修改每个条带的边界。​​

多数图像分析软件都允许您查看泳道轮廓，将条带显示为模拟电泳图中的峰。条带边界可以在此视图中精确定位。​

泳道和条带分析的最后一步是确定要扣除的背景。使用“泳道轮廓”工具可以清晰显示条带和背景。在“泳道”工具中，通常使用圆盘变化来确定背景。

这种方法是通过想象一个直径可变的圆盘“滚动”在泳道中来实现的。如果条带峰足够宽，圆盘将“向上掉落”到条带峰之中并确定背景水平。改变圆盘大小，可以删除更多或更少的背景。较小的圆盘尺寸适合连续的条带峰，允许更大的背景扣减。相反，大尺寸的圆盘不适合连续的条带峰，会减少背景值。

这种方法允许基于局部背景扣除，也可对某泳道/所有泳道使用单一背景扣除设置。

绿色区域表示扣除背景后剩下的信号。左图：大的圆盘使条带中的大部分区域保持不变，因为它无法“向上掉进”每个峰中。右图：一个小的圆盘向上移动到峰中并扣除更多信号。为了确定减去的背景信号是否足够或过大，将一条泳道的图像放置在色谱图下面。

大圆盘

小圆盘

使用大圆盘（中间图）会在条带区域（绿色区域）中留下很多背景。一个小圆盘（右图）可以很好地消除膜背景并只留下来自条带的真实信号。

为了获得最准确的定量结果，请对所有泳道选择一样的圆盘大小来扣除背景。

乍看下来，这个印迹结果表明处理会降低目标蛋白的表达。

但是两个泳道上样量不同，我们就不能得出目标蛋白下调的结论。通过归一化，才可以推断出目标蛋白是真正上调还是下调。​

在蛋白免疫印迹中，归一化是为了校正数据，因为操作中移液上样差异、样品浓度差异或蛋白质转移差异会导致实验误差。归一化过程可校正这些误差，使您的蛋白免疫印迹更加具有可定量性，令蛋白免疫印迹上信号的差异真实反映样品之间的蛋白表达差异。

归一化依赖于上样控制作为参考，该参考用于校正以上的各种实验误差源。

有两种类型的常用内参。第一种是存在于所有样品中的蛋白质，并且预计其表达不因实验处理而改变，通常称为管家蛋白。第二种是用非特异性试剂显示出所有蛋白条带，给出总蛋白信号作为内参。

无论哪种类型的内参，内参信号变化都应表明实验条件的差异，有效的归一化策略需要满足两个先决条件。

归一化校正操作简单明了，一些成像软件中已经包括归一化计算工具。无论手工执行该过程，还是依靠软件工具，整个过程和原理都是相同的 — 即使用数学校正来补偿样品上样之间的差异。

第一步是定量目标蛋白、每个泳道中内参、以及需要扣除的背景。接下来，在印迹上选择参考泳道。参考泳道通常是第一个样品泳道，也可以是您选择的任何其他泳道。归一化过程实质上是要补偿样本上样的差异，因此可以选择任何泳道作为参考。然后，通过将参考通道的信号除以其他通道信号来确定归一化因子，得出每个通道的归一化因子，将目标蛋白的信号乘以归一化因子。

注意：某些软件通过使用参考通道信号作为分母来计算归一化因子。在这种情况下，目标蛋白的信号除以归一化因子即可。

管家蛋白是最常用的上样内参。这些蛋白通常存在于所有实验样品中，并且假定不受实验处理的影响。常用的管家蛋白包括β-actin、GAPDH、tubulin和HPRT1，它们与目标蛋白一起检测。管家蛋白信号的差异表明上样有差异，转移不均匀或其他变化。

要进行归一化计算，首先要定量所有泳道中目标蛋白和管家蛋白的信号。

然后选择一条泳道作为参考泳道，从数学上讲，任何泳道都可以用作参考，归一化因子将以相对于参考泳道的比率应用于所有其他泳道。​

然后，使用参考泳道作为分子，通过推导每个泳道中管家蛋白信号的比率，确定每个泳道的归一化因子。该比率反映参考通道与其他通道之间的样品上样差异。​

最后通过将蛋白信号乘以该泳道的归一化因子，从而获得目标蛋白校正后或归一化后的信号。该信号用于泳道之间准确比较蛋白的相对表达。

使用管家蛋白进行归一化需要满足以下两个条件：

管家蛋白归一化容易受到以上两个条件的影响，必须注意。

管家蛋白的表达水平可能由于以下原因而发生改变：​

使用管家蛋白作为上样内参要求其在所有样品中表达恒定，并且实验处理不会导致其变化。已发表的论文显示了常用内参蛋白差异表达的几个例子（ Ghosh R et al. 2014 and Eaton SL et al. 2013)。

因此，在使用管家蛋白作为上样内参之前，请通过实验验证其表达是否稳定，并真实地反映样品上样量。​

验证样本中肿瘤组织和非癌组织之间的五个候选管家蛋白和总蛋白差异。管家蛋白的印迹结果显示线性差，且不能准确代表细胞裂解物的蛋白含量。 总蛋白显示出一致的条带强度。 Hu X et al. (2016). Common housekeeping proteins are upregulated in colorectal adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma, making the total protein a better "housekeeper."

0.5–4 µg HeLa细胞裂解物中tubulin、actin和GAPDH的线性关系。GAPDH信号已饱和，无法用于归一化。

可靠的归一化要求目标蛋白和内参信号均在其线性动态范围内。然而情况往往是：管家蛋白高表达，目标蛋白低表达。因此，要检测目标蛋白需要加大上样量，导致看家蛋白过载，超出其线性范围。​

将总蛋白定量用于蛋白免疫印迹的上样内参（总蛋白归一化，TPN）可以解决管家蛋白作为内参的一些不足。总蛋白水平可以通过用总蛋白染色（如 SYPRO Ruby，Ponceau S 或 Bio-Rad 的 Stain-Free 技术）对胶或膜进行染色来确定。

总蛋白染色比抗体免疫检测灵敏度低，所以此方法信号过饱和的可能性要小得多。总蛋白在 10–50 μg 细胞裂解物的常规上样范围内表现出良好的线性。因此，总蛋白归一化可以成功地用于大多数蛋白免疫印迹实验，特别是低表达水平的目标蛋白，这样目标蛋白和总蛋白信号就都在各自的线性范围内。

由于总蛋白归一化用整个蛋白上样量作为内参信号，因此，它自然不易受单一蛋白表达变化的影响。

用Stain-Free免染图像做归一化定量

总蛋白信号的泳道分析有助于去除背景并优化条带检测。

首先要定量目标蛋白信号以及每个泳道中的总蛋白信号。 Image Lab 软件包含用了总蛋白归一化的工具，可非常方便的进行此操作。

然后选择一条泳道作为参考泳道。在数学上，任何泳道都可以用作参考，因为归一化因子将以相对于参考泳道的比率应用于其他泳道。

然后，使用参考泳道作为分子，通过计算每个泳道中总蛋白信号的比例关系，确定每个泳道的归一化因子。该比率为参考泳道与其他泳道之间的样品上样差异。

然后将蛋白信号乘以该泳道的归一化因子，这会在印迹的其他泳道中为目标蛋白提供校正或归一化化后的信号，以在泳道之间准确比较蛋白的相对表达水平。​​

了解更多关于总蛋白内参归一化 »

许多分析软件都有估算目标蛋白分子量的工具。需要有一个泳道作为分子量标准（marker），然后根据marker的已知分子量条带绘制出一个标准曲线。

蛋白分子量的对数与条带的相对前沿 （Rf）之间存在线性关系（Rf 是指蛋白迁移距离与染料迁移距离的比值）。将 marker 已知分子量的对数作为Rf的函数绘制标准曲线，该标准曲线具有一定的斜率和截距，未知蛋白的分子量可在此标准曲线上计算得出。

利用SDS-PAGE凝胶测定蛋白质分子量时，需要借用蛋白分子量对数与相对前沿Rf之间的线性关系。

测量从凝胶顶部到每个marker及染料前沿的距离。

计算每个marker的 Rf（相对前沿）

Rf  =

到条带的距离

到染料前沿的距离

Rf 应与 marker 分子量的对数呈线性关系

用相同公式计算未知蛋白的 Rf

将 marker 的 log（MW）作为 Rf的函数绘图。

推导出拟合方程式 y=mx+b，解出 y 值，即可求出未知蛋白的分子量

图像分析软件通常包含分子量计算工具，只需要您确定使用的蛋白marker种类，确定目的蛋白条带，设置起始孔位置和染料前沿位置，软件就可以进行分子量的自动拟合计算。

很多图像分析软件都包含测定分子量的工具。这里我们以 Image Lab 软件为例介绍分子量计算的过程。 第一步是获取凝胶图像，凝胶上应至少有一条 marker 的泳道。为了获得更准确的结果，最好在第一泳道和最后一个泳道上都跑 marker。​​

定义凝胶上的泳道，将上样孔底或分离胶顶部设置为泳道顶部。将泳道框的底部设置在染料前沿位置​ 在 marker 和样品泳道中检测条带。

在软件中，输入所用marker的类型（或直接输入marker分子量数据），并指示软件将哪些泳道作为marker泳道。​​

该软件将自动绘制分子量作为Rf的函数，并在曲线中插入目标蛋白的分子量。​​​

在 Image Lab 软件中，还允许使用其他曲线拟合方法，如点到点。这可能为其他凝胶情况提供更好的拟合方式，例如不均匀丙烯酰胺凝胶或仍处于堆积胶中的条带。​

了解更多关于Image Lab软件 »

优化蛋白印迹 微弱条带或不均匀背景会使定量分析具有挑战性。为减少这些不利因素的影响，最好的方法是优化上游实验步骤。请参阅本指南前面的章节，以改善凝胶分离，降低背景，获得更清晰的目标条带。

验证定量工具 最好方法是用已知量的蛋白做一个预实验。例如，跑一个印迹，其中各通道上样量分别为20 µg、15 µg和10 µg总蛋白。经过软件定量分析，目标条带的相对定量应为2、1.5和1。然后尝试不同的定量工具和设置，直到结果接近正确的预估值。

验证内参 当使用管家蛋白作为归一化的内参时，确保其表达不会因实验处理而改变。如果管家蛋白发生表达量差异，那么定量就会不准确。在预实验中最好测试多个候选管家蛋白，以选定最优的内参。

通过建立合适的内参来比较蛋白表达变化，以纠正常见实验误差，如样品制备不一致、加样错误和蛋白质转印不均匀。

在凝胶和印迹上显示蛋白，不需染色和脱色步骤，然后使用总蛋归一化进行定量。

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