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作者：

顾金燕

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摘要：

猪圆环病毒2型(Porcinecircovirusetype2,PCV2)是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员,它是闭合环状的单链DNA病毒,无囊膜,基因组全长1767bp或1768bp,采取滚环复制模式,它的三个主要开放阅读框为ORF1,ORF2和ORF3,ORF1编码复制相关蛋白Rep和Rep',ORF2编码核衣壳蛋白Cap,ORF3编码的蛋白与细胞凋亡相关.PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweanmulti-systemwastingsyndrome,PMWS)的主要病原,PMWS的主要表现为淋巴组织损伤和免疫功能的抑制,给世界养猪业带来了巨大的损失. 免疫刺激能够促进PCV2在体内的增殖并加剧临床感染,一定量的猪α干扰素能够在PK-15细胞上促进PCV2的增殖,为了揭示这种现象是否与位于PCV2rep基因启动子区的类干扰素刺激反应元件(interferon-stimulatedresponseelement,ISRE,nt1737-1751)有关,我们构建了类ISRE突变的PCV2病毒,将其与亲本毒株在PK-15细胞上的复制效率,对猪α干扰素(poIFN-α)刺激的反应和在猪体上的复制效率,诱导机体产生抗体的能力进行了比较,还用虫荧光素酶报告基因试验检测rep基因启动子活性及病毒ISRE生物学功能,为免疫刺激增强PCV2复制的现象提供理论基础. PCV2Cap蛋白第143-145位氨基酸(N143YS)存在一个保守的N-糖基化位点,PCV2能否利用这个糖基化位点改变Cap蛋白的免疫原性成为本实验另一个研究重点,我们构建了N-糖基化位点缺失与不缺失的Cap真核表达质粒并进行了免疫特性测定,为揭示Cap蛋白N-糖基化位点生物学功能及开发PCV2DNA疫苗奠定基础. 1.PCV2JSDT株感染性克隆的构建,病毒拯救及类ISRE基因突变病毒的构建 PCV2是PWMS的主要病原.本实验用PCR扩增出分离到的江苏东台株(PCV2JSDT)的基因组全长,利用EcoRⅠ酶切位点将病毒全基因克隆入pUC18载体,得到pUC18-PCV2质粒.大量制备重组质粒后将病毒的全基因酶切下来并用T4连接酶体外环化后转染PK-15细胞构建病毒感染性克隆并拯救出PCV2JSDT株.为了研究PCV2基因组中ISRE的生物学功能,本研究设计了突变引物并利用重组PCR技术将重组质粒pUC18-PCV2中病毒基因组中的类ISRE进行了定点突变,而后利用相同的感染性克隆方法拯救出类ISRE单点突变和多点突变的病毒.重组病毒由免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)和基因测序进行双重鉴定,结果显示病毒拯救成功,病毒基因组序列也与预期相符,并未出现基因突变.以上实验为进一步探索PCV2基因组中ISRE基序的生物学功能提供了技术平台并鉴定了重要基础. 2.PCV2rep基因启动子区类ISRE单点突变病毒的生物学特性研究 PCV2是近年来发现的一种重要的动物病原,适量的猪干扰素能促进其在细胞中的增殖.为了揭示PCV2rep基因启动子区类ISRE在病毒中能否发挥生物学功能,本研究对2株ISRE单点突变的重组PCV2病毒在PK-15细胞上的遗传稳定性,增殖特性及对poIFN-α刺激的反应特性进行了分析.结果显示,PCV2rep基因启动子区类ISRE单点突变后PCV2仍可在PK-15细胞中正常复制,但病毒滴度比亲本毒株下降.PCV2G-Cmut在PK15细胞上3至10代之间遗传稳定,PCV2A-Tmut在PK-15细胞上第3代病毒保持突变基因的特征,但传至第7代时-75和-74位的AC突变为TT,并一直保持到第10代.100U/mL的PoIFN-α处理感染病毒的PK-15细胞后,亲本毒株和2个突变毒株的阳性感染细胞数量均有增加,但亲本毒株病毒粒子数的增加显著高于2个突变毒株.根据结果推测PCV2rep基因启动子区类ISRE的突变影响其启动子活性,并可能在干扰素促进病毒增殖中发挥调控作用. 3.PCV2rep基因启动子区类ISRE三点突变病毒的生物学特性研究 免疫刺激能够增强PCV2的复制并引起宿主发病,poIFN-α能增强PCV2在PK-15细胞上的增殖能力,这些现象都可能与PCV2基因组中的ISRE有密切关系.为了进一步探索ISRE对于PCV2的作用,本研究将ISRE3点突变的重组病毒PCV2mut与亲本毒株PCV2JSDT在体内和体外进行了一系列比较试验,结果发现,ISRE3点突变后在PK-15细胞上的复制效率和对poIFN-α的反应能力均显著下降,而且PCV2mut在猪体内的复制效率和刺激机体产生抗体的能力都比PCV2JSDT弱.这些试验证明不管在体内还是体外,类ISRE不仅影响着PCV2的复制效率,还是poIFN-α刺激PCV2增殖的重要元件,甚至影响着PCV2刺激机体产生特异性抗体的能力.这些发现为免疫刺激能增强PCV2感染的现象提供了理论基础,也推进了对PCV2感染机体后宿主与病原之间相互作用复杂机制的理解. 4.PCV2含类ISRE的rep基因启动子活性分析及poIFN-α刺激对其活性的影响 PCV2基因组中的类ISRE位于rep基因启动子区,本实验根据软件预测的rep基因启动子上各类相关位点的分布情况将其分成5个不同的片段分别插入虫荧光素酶报告基因启动子测试载体pGL-Basic中,构成pGL-355,pGL-194,pGL-106,pGL-270,pGL-108等5个重组质粒,转染PK-15细胞后检测相对荧光素酶活性来衡量各启动子活性,发现rep基因启动子由两个小启动子组成,其中一个包含1个ISRE基序,另一个则包含3个SP1位点,此结论又得到绿色荧光蛋白报告基因启动子活性测试实验的验证.为了进一步探索类ISRE在rep启动子内是否具有干扰素刺激反应元件的功能,本实验将含类ISRE基序的启动子测试载体pGL-194和pGL-106转染PK-15细胞,在100U/mLpoIFN-α的作用下转录活性分别提高了135%和220%,而无ISRE基序或ISRE基序发生突变的启动子测试载体则对poIFN-α刺激没有反应,说明ISRE基序对于poIFN-α增强rep启动子活性的作用是必须的,类ISRE在rep启动子中具有干扰素刺激反应元件的功能. 5.独立于PCV2基因组外的类ISRE对poIFN-α刺激的反应 PCV2中类ISRE是否能独立于病毒外单独地产生生物学功能,本研究将ISRE,3个碱基突变的ISRE3个串联后插入经过改造的最小增强子测试载体pGL-mini中,构成重组质粒pGm-PCV2-ISRE(3)和pGm-PCV2-ISREm(3),同时将GBP基因中的ISRE基序3个串联后插入pGL-min中构建阳性对照质粒pGm-GBP-ISRE(3).将pGL-mini,pGm-PCV2-ISRE(3),pGm-PCV2-ISREm(3)和pGm-GBP-ISRE(3)同时转染PK-15细胞,pGm-PCV2-ISRE(3)产生的荧光素酶活性是阴性对照的4倍,说明PCV2类ISRE基序具有一定的增强子功能;在100U/mL的PoIFN-α处理的情况下,pGm-PCV2-ISRE(3)产生的荧光素酶活性是阴性对照的10倍,是不加PoIFN-α处理的2.5倍,而PoIFN-α刺激对pGm-PCV2-ISREm(3)的荧光素酶活性并无多大影响,以上实验说明PCV2基因组中的类ISRE确实能独立于病毒外单独地发挥干扰素刺激反应元件功能. 6.PCV2Cap蛋白及其N-糖基化位点突变体的真核质粒构建. PCV2的Cap蛋白是PCV2的主要免疫原,在Cap蛋白的143-145位氨基酸存在一个推定的N-连糖基化位点.为了验证此糖基化位点确实能使Cap蛋白糖基化,本实验将cap基因插入pcDNA3真核表达载体中构建成重组真核表达质粒pCap,并利用点突变试剂盒将重组质粒中N-连糖基化位点进行点突变,构建成糖基化位点缺失的Cap蛋白真核表达质粒pCap-m;将pCap和pCap-m转染PK-15细胞,用间接免疫荧光实验证明两者均能在真核细胞内有效转录和表达;表达的蛋白经N-糖苷酶(PNGaseF)作用后western-blot分析显示N-糖基化位点缺失质粒pCap-m比pCap在PK-15细胞内表达的蛋白分子量小,说明此糖基化位点确实能使Cap蛋白糖基化. 7.PCV2Cap蛋白N-糖基化位点缺失对Balb/c小鼠的特异性免疫影响 为了评价N-糖基化位点对于PCV2Cap蛋白介导的特异性免疫反应的影响,将构建的糖基化位点缺失与不缺失的Cap蛋白真核表达载体pCap-m,pCap作为DNA疫苗免疫Balb/c小鼠.将7-8周龄Balb/c小鼠平均分成4组,分别注射pCap,pCap-m,pcDNA3和PBS,共免疫3次,通过检测抗体水平,抗体亚型,淋巴细胞增殖情况,细胞因子水平和淋巴细胞亚型等免疫指标来评价Cap蛋白上N-多糖在诱导Cap特异性免疫反应中的作用.结果表明,pCap-m诱导产生的Cap蛋白特异性T淋巴细胞增殖活性,CD8+T淋巴细胞百分比,IgG2a/IgG1比值以及IFN-γ水平都明显高于pCap诱导产生的(P