PCR扩增反应的基本操作及理论知识Word格式.docx

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2．酶及其浓度TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。

TaqDNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94000Da。

具有5’-->3的聚合酶活力，5’-->3’的外切核酸酶活力，无3’-->5’的外切核酸酶活力，会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-4～10-5。

此酶的发现使PCR广泛的被应用。

此酶具有以下特点：

（1）耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2小时后为原来的40%。

吸头是否匹配？

 ——使用原装匹配的吸头装配吸头时有无上紧？

移液器内部气密性不好？

怀疑二：

液体、移液器、吸头以及环境的温度差异是否会影响移液器的准确度？

移取液体的温度与吸头和移液器的温度不一致的情况下，液体温度高于吸头的，移取的液体体积会偏大，液体温度低于吸头的，移取的液体体积会偏小。

怀疑三：

液体样品的密度和水是否有非常明显的区别？

移液器出厂前的校准是用水作为标准液进行测试的，如果所操作的液体与水的比重有很大差异，所给出的不精确度和不准确度就不能满足，从而产生误差。

怀疑四：

吸液速度太快，是否会导致移液体积不准确？

吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。

ps：

移液器长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，延长移液器的使用寿命。

第二节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

PCR基本原理:

怀疑一：

移液器是否有漏气？

1. 自行检测：

目视法检测：

将吸取液体后的移液器垂直静置15秒，观察是否有液滴缓慢的流出。

若有流出，说明有漏气现象。

2. 可能的原因：

- 这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。

引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。

∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。

应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高。

引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

需要注意的是，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

（5）引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。

引物设计也极大的影响扩增产量：

若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。

当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。

对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

（1）引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。

引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，但不应大于38bp。

引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。

（2）引物碱基构成引物的G+C含量以40～60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。

其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5～10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

（3）引物二级结构引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。

这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。

吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面将移液器垂直挂在移液器支架上用大量程的移液器移取小体积的液体移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求吸取具有强挥发性的液体如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发，同时，建议使用外置活塞式移液器。

吸液速度和放液速度过快慢吸慢放三、实验室内移液器的自行快速检测移液器在使用过程中，如果怀疑其精确度，可根据以下提示自行检测：

多次冻融会使dNTP降解。

dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

4．模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

SDS的主要功能是：

溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。

引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。

应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。

（4）引物3’端序列引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。

如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。

引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。

应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。

引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。

（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。

（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。

PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同实验对象的酶等。

一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u（总反应体积为50μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3．dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。

HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。

是以基因组DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、DNA聚合酶、Mg2+等。

因此参与PCR反应的物质主要为五种：

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

1．引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

引物设计有3条基本原则：

首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。

多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发液体。

3.错误的操作方式错误：

装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧正确：

插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头吸头与移液器不匹配，影响气密性选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头吸液时，移液器倾斜吸液垂直吸液引物5′端修饰包括：

加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。

（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。

（7）引物稀释通常引物稀释会稀释成10~20μM，也不排除做其他的用途使用，如Oligo（dT）、RandomPrimer均稀释为50μM。

慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度放液时吸头尖端靠在容器内壁2.移液小技巧●预润湿吸液 粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到精确移液，先吸入样液，打出，吸头内壁会吸附一层液体，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。

●正向吸液与反向吸液正向吸液是指正常的吸液方式（见图4），操作时吸液可将按钮按到第一档吸液，释放按钮。

放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。

反向吸液（见图5）是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体，打出液体时只要按到第一档即可。