转录组分析是一种用于研究细胞或组织中所有RNA分子的表达水平的高通量技术。完成转录组分析后，科学家们通常需要通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）来验证二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）结果的可靠性。这是因为qRT-PCR是一种精确的定量方法，可以用来验证特定基因的表达水平。

荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR）是一种利用荧光信号来实时监测PCR扩增过程的技术。它允许研究者在PCR反应进行时实时检测DNA的累积量，从而实现对基因表达水平的定量分析。

在进行相对定量分析时，常用的方法之一是双标曲线法（也称为标准曲线法或绝对定量法）。这种方法的基本步骤如下：

通过这种方法，研究者可以验证NGS结果的准确性，并进一步探索基因表达的调控机制。ΔCt法，2-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的2-ΔΔCt法(Livak法):

该部分引用自下方参考链接1

qRT-PCR原理

以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

Ct值

Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期，在平台期之前，PCR 扩增就是简单的指数增长，也就是 1 变 2，2 变 4，4 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方，到了平台期所有基因扩增的数目是一致的，而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。这里可以得到公式：

计算 -ΔΔCt：内参基因分为对照组和处理组内参基因

先计算对照组和处理组的内参基因Ct的均值： M e a n 内参基因 = m e a n ( 对照组或处理组内参基因 ) Mean_{内参基因}=mean(对照组或处理组内参基因) Mean内参基因​=mean(对照组或处理组内参基因)

计算对照组待检测目的基因减去对照组内参基因的平均Ct值： Δ C t 对照组目的基因 i = C t 对照组目的基因 i − C t 对照组内参基因的平均值 ΔCt_{对照组目的基因i} = Ct_{对照组目的基因i} - Ct_{对照组内参基因的平均值} ΔCt对照组目的基因i​=Ct对照组目的基因i​−Ct对照组内参基因的平均值​

计算处理组待检测目的基因减去处理组内参基因的平均Ct值： Δ C t 处理组目的基因 i = C t 处理组目的基因 i − C t 处理组内参基因的平均值 ΔCt_{处理组目的基因i} = Ct_{处理组目的基因i} - Ct_{处理组内参基因的平均值} ΔCt处理组目的基因i​=Ct处理组目的基因i​−Ct处理组内参基因的平均值​

计算基于对照组的-ΔΔCt，处理组待检测目的基因的ΔCt减去对照组待检测基因的ΔCt的平均值： − Δ Δ C t 处理组目的基因 i = Δ C t 处理组目的基因 i − Δ C t 对照组目的基因 i 的平均值 -ΔΔCt_{处理组目的基因i} = ΔCt_{处理组目的基因i} - ΔCt_{对照组目的基因i的平均值} −ΔΔCt处理组目的基因i​=ΔCt处理组目的基因i​−ΔCt对照组目的基因i的平均值​

相对表达量计算，也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct: 2 − ( − Δ Δ C t ) 2^{-(-ΔΔCt)} 2−(−ΔΔCt)

条形图或相关性点图可视化结果