数字PCR（二） |
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1.数字PCR优势
数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变 image.png 终点检测 无需标准曲线的绝对定量 对PCR扩增效率不敏感 对PCR抑制剂耐受程度高 2.Bio-rad QX200介绍 2.1 系统组成 image.png 2.2. 操作流程 image.png 2.2.1. 反应液准备及芯片加载 image.png 微滴生成仪为压力装置，每条微滴发生卡可以做8个样本，每次进行ddPCR实验，样本需为8的倍数，不够的样本数，以NTC补齐 到检测样本在转移至微滴发生卡前，需要充分混匀，且需要避免产生气泡 转移样本至微滴发生卡过程中，可悬空加液，避免产生气泡，如有气泡，需用干净枪头扎破 加微滴生成油过程中，应注意加液手法保持一致，进而使得后续微滴生成过程中，每孔压力相同 从微滴发生卡中转移微滴时，需控制移液速度，尽可能将微滴全部转移（该步骤可以将移液器量程预调至42μl，转移微滴时控制手速，在吸取即将完成时停顿3-5s，使微滴能上浮至枪头上部，如果未能吸取完成，可以调大量程移液，该步骤如果操作不当，微滴损失较大） 微滴生成油易挥发，在微滴转移至96孔板后，应及时使用锡箔纸盖住 将微滴转移至96孔板时，尽可能一次移液，一次性打完，避免二次移液造成的污染 2.2.2 微滴生成 image.png 微滴发生卡座底部为磁性材料，在转移过程中，避免与桌面摩擦产生静电，该过程会影响后续微滴生成仪的正常运行 微滴生成仪在使用之前，可以使用75%酒精将内部擦拭，浮尘可能会在微滴的生成过程中，堵塞微滴发生卡 2.2.3. PCR反应后微滴读取 image.png 每个微滴经过双通道检测（FAM，VIC/HEX） 检测速度约为32孔/小时 2.2.4. 微滴读取仪器常见问题 image.png 更换微滴读取油时，需进行Flush system次，primer两次 如瓶灯显示异常，可能是由于废弃油桶已满，或者读取油体积不够，如果这两者都不是，则可能是由于油桶侧壁上有油滴，此时会让液面传感器检测出错 将96孔板放入微滴读取仪时，需小心操作，并检查是否固定牢固，否则可能会损坏仓门 微滴读取仪的仓门开关按下后，如果无法自动开启，请重启后再次尝试 读取仪探针孔，需要定期使用75%酒精进行清洗 2.2.5. 数据解读 2.2.5.1 一维图（1D） image.png 2.2.5.2 二维图（2D） image.png 2.2.5.3 数据分析原理阳性微滴比例p image.png上样量（拷贝数）与阳性微滴占比 image.png Copies per droplet = -ln（1-p）， p = fraction of positive droplets 仪器统计阴阳性微滴数，并计算阳性微滴的占比，根据泊松分布对其进行修正，计算出每个微滴中所含有的阳性拷贝数，根据理论微滴总数（每个微滴体积默认为1nl，20ul体系中微滴总数为20000个）即可计算出阳性的总拷贝数，其原理就是对理论值为20000的微滴总体中进行抽样，根据经验，如果检测到的实际微滴总数超过10000，则我们认为数据可靠，可以用于计算CPD（copies per droplet），如果微滴总数小于10000，则实验数据不可靠，需要重复测试，一般熟练操作者，可保证微滴总数在17000以上 系统的检测范围在1~100000copies/20μl（数字PCR的原理是基于泊松分布，所以整个体系中必须要有阴性微滴存在，而根据上图图，总上样量超过100000copies时，系统中无阴性微滴存在，无法根据泊松分布进行修正），一般情况下，样本上样总量不超过20000copies/20μl 文献报道的ddPCR方法的检测限一般为0.1%，当然在提高上样量的前提下，可以将检测下限降至更低，但是通常样本很珍贵，我们无法投入太多的样本。 在上样量较高的情况下，5copies/20μl的检测数据也是可靠的 3.数字PCR应用类型 3.1 稀有突变检测Rare Event Detection image.png 如使用Taqman MGB探针检测SNP，单孔检测过程中必须存在竞争型探针，如Mu/Wt探针共存于一孔，否则检测效果极差 数字PCR可以显著提高检测的灵敏度，这在RED实验中占有极大的优势 3.2 拷贝数变异 image.png image.png 4.Tips 4.1 Q：样本上样量方面：在保证实验有效性的前提下，样本最低上样量是多少？A：最低微滴上样量是和您的实验的突变比例灵敏度需求相关的，人类cfDNA的具体上样需求，可见下表 LoD Total copies to screen Diploid cells Amount of DNA to screen Volume of plasma sample* # of wells 1 in 1,000 3,000 1,500 0,010ug 0.2ml 1 1 in 10,000 30,000 15,000 0.10ug 2ml 1 1 in 25,000 75,000 37,500 0.25ug 5ml 1 1 in 100,000 300,000 150,000 1.0ug 20ml 4 1 in 1,000,000 3,000,000 1,500,000 10ug 200ml 40 4.2 Q：20000个微滴要求有阴性微滴，最佳上样量是？A：按照泊松分布原理，小于等于5 copies/droplet（100000copies/20ul）的核酸浓度，都能保证总体内有空余微滴存在，通过统计学换算，都可以保证结果稳定，并非必须要求每个微滴单拷贝。20,000个微滴对应的是100,000个拷贝的核酸。即使总微滴数有损失，一般15,000个微滴对应的检测上限也应该是75,000个拷贝。 理论上讲只要有还有1个阴性微滴，ddPCR基于Possion分布都能计算出样本的含量，但是CV%会非常大。可以接受的动态范围是CV%T transition）,靶标序列variation, 生化反应本身的随机性，还有就是最重要的样本交叉污染，气溶胶污染。有些因素的可以竭力控制的，使得FPR尽量的低。尽管如此，通过严格的设计和质控来控制FPR不是不可能的，可使FPR接近零的水平。 Cutoff值的设定，对于某个assay来说，其实不是纯粹技术上的问题，还涉及到产品类型、策略、市场定位，检测目标等考虑因素。过低的Cutoff，可提高灵敏度，筛出更多“阳性”病人，但是也增加了假阳性的风险，企业承担更大的风险 4.9 biorad ddPCR的分析灵敏度、重复性在什么水平？ 理论灵敏度为1个拷贝核酸。实际灵敏度针对您的不同Assay及不同提取手段是需要具体分析的，重复性在不同Assay的不同的浓度范围内也是不同的。您需要参考文献、自身实验、或FDA医疗器械注册时的验证数据。 对于一台PCR仪器一般很少有用分析灵敏度的说法，因为每一种不同的序列都可以判断为不同的分析物，同一种方法针对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和应用试剂。 4.10 Q：每个微滴的体积在Quanta Soft中的算法是多少？A：Bio-Rad不同的ddPCR supermix产生的微滴体积都有差别，这就是为什么要在setup实验时，要在软件中正确选择对应的supermix种类，软件会自动调用对应试剂的微滴体积进行计算。不同试剂的微滴体积，在研发时已经通过测试获得并应用于quantasoft软件的计算中 4.11 Q：分析软件中的merge功能及在什么情况下使用？A：1.单孔微滴数量不够，2. 单孔样本上样量不够，3. 需要计算技术重复间的平均值和置信区间。如果实验中有perform技术重复，通常情况下建议merge各技术重复的微滴进行分析，可提高数据的精确度 4.12 Q：分析软件lasso功能在什么情况下使用？A：双重ddPCR实验中，如果两重反应间互有干扰或竞争（表现形式一般为四团微滴无法处于矩形的线上），则使用索套法划分微滴会更精确。（如有实例，可现场讨论） 4.13 Q： 使用ddPCR开发assay是以拷贝数还是以突变比例作为LOD?这两个定量结果其实并不矛盾。但对于ddPCR开发的mutation detection assays, 到底该用拷贝数还是用突变率作为LOD仍然有待讨论。对于Liquid biopsy来说，可能两个检测结果同时分析才更有实际指导意义。个人倾向于用拷贝数浓度，而野生型的结果是必不可少的IPC。突变比例的测定可能会受样本制备的影响。 4.13 Q：从伯乐ddPCR资料中有如下校正情况，请问：为什么需要校正？在什么条件下需要校正？如果加入新的荧光标记或者阴性微滴的本底荧光信号出现负值时，需要校正补偿。 |
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