细菌的qPCR检测 |
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细菌的qPCR检测
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特定细菌的检测检测内容
实验流程
结果展示
样品要求
文献案例
检测对象：
采用qPCR的方法检测样本中总细菌或是针对某种感兴趣的特定种类细菌进行定量，得到其绝对拷贝数。 检测对象为：细菌微生物。 细菌的总拷贝数一般是基于16S rRNA的V3V4区，或V4V5区，或其他老师指定的区域进行绝对定量，16S rRNA的引物示意图如下。  特定种类细菌一般是根据老师提供的物种信息，进行相关引物的查询，对目标细菌拷贝数进行绝对定量或是与16S总细菌的拷贝数进行相除，得到相对含量。菌标已经检测过的部分细菌见下表： 级别 中文名称 英文名称 界 细菌 Bacteria 门 放线菌门 Actinobacteria 门 拟杆菌门 Bacteroidetes 门 厚壁菌门 Firmicutes 纲 alpha变形菌纲 Alpha-proteobacteria 纲 gamma变形菌纲 Gamma-proteobacteria 科 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 科 瘤胃球菌科 Ruminococcaceae 属 双歧杆菌属 Bifidobacterium 属 大肠杆菌属 Escherichia 属 乳酸杆菌属 Lactobacillus 属 梭菌属 Clostridium 属 肠球菌属 Enterococcus 属 拟杆菌属 Bacteroides 属 奇异菌属 Atopobium cluster 属 链球菌属 Streptococcus 属 瘤胃球菌属 Ruminococcus 属 粪杆菌属 Faecalibacterium 属 布劳特菌属 Blautia 属 艰难梭菌属 Clostridium difficile 属 脱硫弧菌属 Desulfovibrio 属 另支菌属 Alistipes 属 链球菌属 Streptococcus 属 萨特氏菌属 Sutterella 属 丙酸杆菌属 Propionibacterium 属 假单胞菌属 Pseudomonas 属 噬酸菌属 Acidovorax 属 不动杆菌属 Acinetobacter 属 鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas 属 分枝杆菌属 Mycobacterium 属 普氏菌属 Prevotella 种 溶纤维丁酸弧菌 Butyrivibrio fibrisolvens 种 蛋白溶解梭菌 Clostridium proteoclasticum 种 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 种 青春双歧杆菌 Bifidobacterium adolescentis 种 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus 种 粪肠球菌 Enterococcus faecalis 种 呀卟啉单胞菌 Porphyromonas gingivalis 种 阴道加德纳菌 Gardnerella vaginalis 种 鼠乳杆菌 Lactobacillus murinus 种 解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 种 芽孢杆菌 Bacillus velezensis 种 Akkermansia muciniphila 株 唾液链球菌 K12 Saliva streptococcs qPCR的原理：实时荧光定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。 3种荧光试剂的工作原理及区别： SYBRGreenⅠ法： 嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 TaqMan探针法： 扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步   SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别： 方法 优点 缺点 SYBRGREE 高灵敏度，操作简单，不影响酶促反应，价格便宜 1 对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析 2 灵敏度相对较低。 TaqMan 1 具有高度特异性 2 更高的灵敏度 3 可同时检测几种不同的荧光信号的产物 1 探针价格较高 2 需要不同引物的扩增效率一致，扩增条件要求比较高qPCR的实验方法： 实验方法 原理 技术应用 绝对定量(AQ) 基因在样本中的分子数，即通常所说的拷贝数。 特定微生物的拷贝数检测 特定功能基因的拷贝数检测 特定抗性基因的拷贝数检测 相对定量(RQ) 基因在样本中的含量的相对比例，一般是通过CT值之差来计算。 特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 功能基因的微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 抗性基因拷贝数占全部微生物拷贝数的比例相对定量和绝对定量的数据计算方法 标准质粒拷贝数计算： 每微升拷贝数（copies/μl）=[质粒浓度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量 原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数 原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=（原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积）/样本抽提重量，（如果客户样本为DNA样本，则不需要计算copies/g样本） 相对定量的计算： 步骤1:内参基因均一化样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct 步骤2:其他样本和对照样本比较：△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct 步骤3:使用公式计算：倍数变化=2–△△Ct qPCR的实验流程：
qPCR结果：
标准曲线  扩增曲线  熔解曲线  定量结果 编号 拷贝数 样本稀释倍数 样本重量（g） 基因组DNA体积（μL） 基因拷贝数copies/μL DNA 1 1.08E+06 200 0.237 50 2.17E+08 1 1.23E+06 200 0.237 50 2.47E+08 1 1.07E+06 200 0.237 50 2.14E+08 2 7.28E+05 200 0.24 50 1.46E+08 2 7.55E+05 200 0.24 50 1.51E+08 2 7.44E+05 200 0.24 50 1.49E+08术语解释 Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15 基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。 熔解曲线Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。 qPCR检测送样要求： 样本类型 样品量/例 备注 土壤/沉积物/淤泥 1g 湖水/海水/河水 1L，用滤膜或离心富集 过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。 污水 20ml 若样本清亮则可适当地多取。 泥水混合样 2ml 空气 根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。 发酵物 固体 2g，液体 20ml 样本类型 样品量/例 备注 人体 粪便 ≥3g 人体 皮肤 5 个采集拭子 采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。 人体 生殖道 5 个采集拭子 采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。 人体 牙菌斑/舌苔 5 个采集拭子 在采集的部位，刮取 10 次左右。 人体 唾液 10ml 人体 痰液 10ml 或 2-3 口痰液 人体 鼻腔 5 个采集拭子 采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。 人体 肺部灌洗液 30ml 富集液 对灌洗液进行离心富集。 人体 肠道/胃组织 5mm*5mm*3mm 3 块 尽量多一取些。 人体 血液 3ml 全血 用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。 人体 尿液 30mL 尿液 取中段尿为宜。 人体 母乳 5mL 动物 粪便 ≥3g 最少 0.05g。 动物 盲肠/结肠/胃组织 ≥3g 至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本 动物 肠道内容物 ≥3g 最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗提醒： 1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。 2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒 参考文献：1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌门拟杆菌门alpha变形菌gamma变形菌等） 2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌） 3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（双歧杆菌艰难梭菌大肠杆菌探针法） 4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多种菌的定量） |
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