曲彦隆，关正瑞，南飞，刘思遥，刘禄萌 

哈尔滨医科大学附属第一医院骨三科（哈尔滨  150001）

基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目（LH2019H020）；北京康盟慈善基金会医学科研发展基金项目（YXKY-HX2002）

通信作者：曲彦隆

关键词：膝关节；骨关节炎；桑黄素；碳点；壳聚糖水凝胶；大鼠

引用本文： 曲彦隆，关正瑞，南飞，刘思遥，刘禄萌. 负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖水凝胶对大鼠软骨损伤的作用及其机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(12): 1519-1528. doi: 10.7507/1002-1892.202208121 

摘要

目的

构建负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖（ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dots-morin，NMCM）水凝胶，通过体内外实验观察其能否修复软骨损伤，并探讨相关机制。

方法

取壳聚糖联合甲基丙烯酰酐制备紫外光（ultraviolet，UV）交联壳聚糖、联合丙烯酰胺制备碳点，两者混合后加入桑黄素溶液，在UV 下照射交联，获得NMCM 水凝胶，检测其缓释性能。取关节置换患者自愿捐赠的正常及膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）软骨组织，分离培养软骨细胞并经甲苯胺蓝染色鉴定。取第3代KOA软骨细胞，首先分别与12.5、25.0、50.0 µmol/L桑黄素及负载该浓度桑黄素的NMCM水凝胶混合培养，细胞计数 试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测上述浓度桑黄素及水凝胶对软骨细胞增殖的影响；然后与负载50 µmol/L桑黄素的NMCM 水凝胶共培养，免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白（collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ）水平、2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探针检测活性氧水平。取4周龄SD大鼠20只，构建右后肢膝关节软骨损伤模型，随机分为两组（n=10）；其中实验组软骨缺损处注射负载25 µmol/L桑黄素的NMCM 水凝胶，对照组不作处理。术后4周，取标本micro-CT 观察股骨髁软骨缺损修复情况，大体观察缺损部位并行国际软骨修复协会（ICRS）大体评分，番红-O固绿染色及COL-Ⅱ免疫组织化学染色观察软骨和软骨下骨并行ICRS组织学评分，Western blot以及实时荧光定量PCR检测软骨组织中TNF-α、NF-κB、基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、COL-Ⅱ蛋白及mRNA表达。

结果

实验成功构建负载不同浓度桑黄素的NMCM 水凝胶，其短时间内药物释放速度较快，24 h后速度逐渐放缓，96 h时释放量接近于0，此时药物累积释放率达88%。浓度≤50 µmol/L的桑黄素对软骨细胞无毒性作用，且在NMCM水凝胶干预下，软骨细胞增殖能力提高（P