同一组织中的细胞往往具有类似的结构和功能，然而通过对单个细胞进行测序分析后，发现每个细胞都具有一定异质性. 单细胞全基因组扩增技术是进行单细胞测序的前提，该技术可用于揭示单细胞基因组结构差异，同时在肿瘤研究、发育生物学、微生物学等研究中发挥重要作用，并成为生命科学研究技术的热点之一. 单细胞全基因组扩增技术的难点在于单细胞的分离和全基因组的扩增. 本文介绍了单细胞全基因组扩增技术中常用的单细胞分离技术和单细胞全基因组扩增技术，并对各技术间的优缺点进行比较，同时着重讨论该技术在肿瘤研究、发育生物学和微生物学研究中的应用.

Cells in the same tissue often have similar structures and functions. However, it is found that each cell is heterogeneous by sequencing cells. Single-cell whole-genome amplification technology is the premise of single-cell sequencing. This technology can be used to reveal the differences of single-cell genomic structures and it also plays an important role in tumor research, developmental biology, and microbial research, and it has already become one of hotspots in life science research technology. The difficulty of single-cell whole genome amplification techniques lies in the isolation of single cells and the amplification of whole genomes. This paper introduces the popular single-cell separation technology and single-cell whole genome amplification technology and also compares the advantages and disadvantages of each technology. The application of the technology in tumor research, developmental biology and microbiology research was also emphatically discussed.

单细胞分离技术；单细胞全基因组扩增技术；比较；应用

single cell separation technique; single cell whole genome amplification technique; comparison; application.

DNA测序技术的快速发展使得学术界对包括人类在内的各类物种的基因组有了更全面的认识，下一代测序的全基因组扩增（whole-genome amplification，WGA）在生物学和医学领域都有广泛的应用. 人类对于基因组的普遍认识来源于对一类细胞的全部基因组进行测序，但问题是同一个体中的单个细胞由于后天的环境变化会拥有一个独特的基因组，而生殖细胞也会因携带着来自父亲和母亲基因不同的组合而不一样. 例如，生活中常见的异卵双胞胎和同卵双胞胎之间都有着各自的区别. 随着时间的推移，基因组位置会发生随机变化，体细胞相应地就会出现基因组变化，这种基因组变异包括单核苷酸变异（single-nucleotide variations，SNVs）、拷贝数变异（copy-number variations，CNVs）和结构变化，常导致癌症和其他疾病.随着测序技术、单细胞分离技术和全基因组扩增技术的快速发展，单细胞研究技术被列为未来几年最值得关注的技术之一[1]. 在单细胞水平上对基因组进行测序能更好地解决传统技术的局限性问题. Navin等[2]通过利用流式细胞仪对来自多基因组肿瘤的100个单细胞和单株原发肿瘤及其肝转移的100个单细胞进行测序分析，开展肿瘤的进化研究. 单细胞测序技术描述单个细胞的基因组，能够解析细胞间更加细微的差异，探索基因组变异的异构细胞[3,4,5]，揭示了各种生物过程的细节. 例如，构建新的微生物进化树和基因组序列，推动微生物生命活动过程的研究[6,7]，同时对发育生物学、神经科学、免疫、癌症等领域的发展也发挥重要作用，包括胚胎发育[8]、肿瘤进化[2,9,10]等. 不可否认，单细胞测序技术正成为生命科学研究的焦点之一[11]. 如今，单细胞基因组的表征研究越来越受到关注，且单细胞基因组学的重要性在珍稀样本中变得更加显著[12]，例如胚胎细胞[13]和循环肿瘤细胞[9]. 本文从单细胞研究基本技术和应用两方面对单细胞基因组扩增技术的最近研究进展进行了阐述.

根据所用技术原理，单细胞分离技术可以划分为不同种类（表1）. 对各种主要方法我们介绍如下.

表1 不同单细胞分离方法的比较

Table 1 Comparison of different single-cell isolation methods

微流控技术

微流体芯片平行

分离

灵活选样，密闭操作空间

需要专门空间，操作较复杂

用于样品量少的分离研究

荧光标记特异分选

分选准确度高

分选机制复杂，设备昂贵，

有气溶胶危险

显微操作技术

灵活取样，操作简单，

成本低

可能损坏细胞，出错率高

适用于小细胞群体的分离研究

激光定位切割

保证组织完整性

成本高，出错率高，细胞

损坏严重

用于冰冻或石蜡包埋样品分离研究

梯度稀释法是通过将细胞进行梯度稀释，最终得到单细胞的一种简易方法. 其最大优点是技术简单、成本低，对于可以进行培养的样本研究均可用该方法得到单细胞，缺点在于在细胞稀释过程中容易出现分离错误或者丢失. 这种方法在大批量细胞分析中也有一定的应用. 例如，Zhang等[14]在2006年通过Affymetrix芯片杂交分析了两种大肠杆菌的分布情况.

微流控技术是使用具有专用微流体芯片进行平行单细胞分离，捕获单细胞[15]. 微流体装置具有集成的细胞分选器，用于分离选定的单个细胞，从而允许灵活的样品选择且封闭的操作空间可以有效地避免污染. Streets等[16]利用微流控芯片实现单细胞测序，提高了反应效率，减少了操作误差，提高了可靠性和平行性.

荧光激活细胞分选（fluorescence activated cell sorting，FACS）技术[17]借助流式细胞仪，单个细胞有序地通过激光束，利用激光激发荧光素标记的细胞，根据激发的荧光信号对细胞进行高度特异性分选，含有靶细胞的液滴被选择性地偏转到收集器中，是比较常用的单细胞分离技术[18]. FACS系统是在单细胞基础上分离靶细胞，具有更高的分选准确度. 虽然非常有效和准确，但复杂的分拣机制使得FACS系统显得昂贵且笨重，并且潜在的气溶胶也有一定的危险性. 此外仪器中快速流动的液体可能会对细胞的活性和形态状态产生一定的影响[19]，但是对于基因组DNA的研究没有影响.

显微操作技术是利用显微镜直接进行单细胞的分离，是一种较常用的灵活获取单细胞的技术，显微操作系统以倒置显微镜为主. 其关键技术要点在于对培养的细胞进行梯度稀释，如果细胞浓度过高会影响分离和挑取单细胞的准确性. 通过细胞计数板计数将细胞稀释到大约100个/ml，或者每个细胞在缓冲液中是独立分开状态即可，在倒置显微镜的观察下可借助移液器直接挑取单个细胞. 其优点是操作容易进行、可以直接通过可见视野直观地分离单细胞、成本低、主要是用于较小细胞群体的目标细胞的分离. 缺点是通量低、分离过程可能会损伤细胞、而且细胞识别出错率高.

激光显微切割可以在不破坏组织结构，并保证周围组织完整性的前提下将特定的单个细胞从不同的组织中分离出来，此方法常应用于与人类健康相关的单细胞基因组学研究 [20,21]. 其缺点是成本较高、切割不精确，可能会造成遗传物质的丢失.

引物延伸预扩增法（primer-extension preamplification，PEP）是一种出现较早的WGA技术. 1992年应用PEP方法实现单个单倍体细胞基因组的全扩增[22]. 这是一种基于PCR技术的WGA方法，主要是使用了含15个碱基的随机引物，在37℃下退火，并在55℃进行延伸，如此循环复制.

基于热循环以PCR为基础的简并寡核苷酸引物PCR技术（degenerate oligonucleotide-primed PCR，DOP-PCR）[23]，其采用部分简并序列的寡核苷酸引物（引物中间部分含有6个随机碱基），用于基因组作图研究. 该技术在最初几个循环，利用低初始退火温度（~25℃）的PCR方案确保引物与模板结合，从给定基因组内的多个均匀分散的位点引发. 此后进行较高退火温度（~55℃）的常规多循环PCR反应. Van等[24]在传统DOP-PCR技术上提高了其引物的简并性，同时使用4条简并引物进行扩增，每条引物含有8个随机碱基，并将扩增产物与二代测序技术联合使用，使得WGA方法与未知样品研究实现结合. 相对于一般的DNA扩增技术，DOP-PCR是一种快速、高效、独立于一般DNA扩增的技术，但低覆盖率与PCR错误率高常导致单核苷酸变异（SNVs）. Blagodatskikh等[25]在此基础上通过修改引物设计和DNA聚合酶， 改进了DOP-PCR（improved degenerate oligonucleotide-primed PCR，iDOP-PCR）技术，其不仅提高了扩增效率，也提高了扩增质量.

PEP和DOP-PCR都是早期常用的经典技术，不同的序列PCR扩增的效率存在很大的偏差，其中对PCR的扩增方法影响较大的因素是聚合酶和引物浓度，在扩增过程中模板的大小、GC含量、DNA二级结构等都会对聚合酶的扩增效率有影响，不能完全覆盖整个基因组，将导致扩增产物不均匀或者出现非特异性扩增产物、出现扩增偏好性[26,27,28]，给下一步实验分析造成另一种挑战.

多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）是等温的链置换扩增[29]，在恒温条件下，由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火，紧接着在phi29 DNA聚合酶作用下发生链置换反应，置换后的单链又可与引物发生随机结合、退火、延伸，最终形成分支扩增. 与基于PCR的WGA方法相比[27]，MDA通过对染色体8个基因位点的扩增偏差小3倍，而DOP-PCR的扩增偏差可达4~6倍. MDA可从1~10基因组拷贝扩增产生约20~30 μg的产物，平均产物长度>10 kb. 由于MDA是一种等温扩增方法，对模板质量要求相对较高，同时也存在一定的非特异性扩增，在不含模板的情况下也会有扩增产物[15,30]. Leung等[31]用129个正常二倍体细胞的大数据集检测液滴多重置换扩增（droplet multiple displacement amplification，dMDA）技术的性能，结果显示其在扩增均匀性、基因组覆盖度和稳健性方面超过先前报道的单细胞WGA方法. 实现了高达80％的单细胞基因组覆盖率，且利用液滴MDA扩增得到的产物在靶向测序中可有效地进行单核苷酸变异（SNV）检测. 因此，MDA扩增的人类DNA常用于遗传分析，包括单核苷酸多态性的基因分型、染色体绘制、DNA印迹和限制性片段长度多态性分析、亚克隆和DNA测序等. 一般MDA单细胞基因组测序流程如图1所示.

图1 MDA单细胞基因组测序流程

Fig. 1 Single cell genome sequencing process of MDA method

注：从样品细胞群（培养的细胞或者组织）中通过各种单细胞分离技术，分离得到单细胞，对单细胞进行裂解提取其基因组，用MDA方法扩增得到基因组文库，随后进行测序，对数据分析，进行SNP、CNV检测，细胞类型鉴定等.

多重退火和基于环状循环扩增技术（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）是美国国家科学院院士谢晓亮教授所带领的团队在2012年发表了一种新的WGA方法[28]，其引入了拟线性预放大，以减少与非线性放大相关的偏差. MALBAC结合了MDA和基于PCR的WGA技术，以人的单细胞的DNA片段（10~100 kb）作为模板. 具体原理如图2所示.

图2 MALBAC原理图[28]

Fig. 2 Schematic diagram of MALBAC [28]

注：MALBAC首先在0℃条件下与引物均匀地排列在基因组上，与基因组结合，随着温度上升到65℃，引物开始延伸，在94℃条件下延伸后的半扩增子与基因组分离，随后反应又进行0℃-65℃-94℃的循环，半扩增子形成完整的全扩增子，温度降低至58℃，全扩增子环化，如此扩增反应进行5次，环化的全扩增子可进行下一步的PCR扩增反应，最终得到MALBAC扩增产物.

MALBAC由一组随机引物启动扩增，每个引物具有27 nt通用引物序列和8 nt随机碱基，随机引物可以在0℃下与模板均匀杂交. 在65℃和具有链置换活性的DNA聚合酶作用下产生具有可变长度（0.5~1.5 kb）的半扩增子，再经过94℃模板变性、0℃退火和65℃延伸一个循环后半扩增子形成末端互补的全扩增子，紧接着将温度降低至58℃，使完整扩增子环化，以防止DNA进一步扩增和交叉杂交. 把在5个预扩增循环后得到的全扩增子作为模板，27 nt通用引物作为PCR引物，通过PCR指数扩增得到下一代测序所需的DNA. 在相同条件下，MALBAC比MDA方法展现出更高、更均匀的基因组覆盖率，但同时也存在假阳性偏高的结果，可能是因为Bst和Taq聚合酶的保真性不高，以至于扩增过程中准确率低，所以MALBAC需要多个细胞基因组才能获得更为准确的结果[32].

乳液全基因组扩增（emulsion whole-genome amplification，eWGA）适用于任何WGA，其利用油中的少量水性液滴，均匀扩增单个细胞的基因组. 通过将单细胞基因组DNA片段分配到大量（105）皮升液滴中，允许每个液滴中的一些DNA片段达到扩增饱和状态. 经过破乳合并液滴后，DNA片段之间的扩增增益的差异显著最小化. 与MDA、MALBAC和DOP-PCR比较[33]后的结果表明，eWGA不仅提高了覆盖率，而且能够以更高的准确度和更高的分辨率同时检测SNV和CNV，在许多方面优于现有的单细胞扩增方法. 例如，MDA容易受到环境污染，包括试剂中痕量DNA的污染. 相反，eWGA通过应用小的反应量[34,35]，且其反应缓冲液会被分配到大量分离的液滴中，而DNA污染物只存在于一小部分液滴中，不会被过度放大，因此可以有效减少DNA污染物.

2017年，Xie等[36]在《科学》杂志（Science）上发表了一种新的WGA方法，即通过转座子插入的线性扩增（linear amplification via transposon insertion，LIANTI），其结合了Tn5转座[37]和T7体外转录[38]用于单细胞基因组分析，优于现有方法，能够以千碱基分辨率进行微型CNV检测. PCR的指数扩增会造成扩增偏差和错误，限制了其在单细胞基因组学中的应用[39,40]. 在LIANTI方法中，来自单个细胞的基因组DNA，通过特异设计的包含T7启动子LIANTI转座子的Tn5转座而随机片段化. 由T7启动子标记的基因组DNA片段通过体外转录线性扩增成数千个拷贝的RNA，在逆转录和RNA酶消化后，合成第二条链，形成用于DNA文库制备的双链LIANTI扩增子，其原理如图3所示. LIANTI减少了其他单细胞WGA方法中使用的非特异性扩增和指数扩增，从而大大降低了扩增偏差和误差.

图3 LIANTI 原理图[36]

Fig. 3 Schematic diagram of LIANTI [36]

注：LIANTI对来自单个细胞的基因组DNA，随机片段化并用LIANTI转座子标记，随后DNA聚合酶缺口延伸转换单链T7启动子在每个片段的两端环成双链T7启动子. 进行体外转录过夜以将基因组DNA片段线性扩增成基因组RNA，其能够在3'末端自我启动. 在逆转录、RNase消化和第二链合成后，形成标记有独特分子条形码的双链LIANTI扩增子，代表来自单个细胞的原始基因组DNA的扩增产物，并准备用于DNA文库制备和下一代测序.

SISSOR（single-stranded sequencing using microfluidic reactors）是利用微流体反应器进行单链测序的一种方法. 该方法用于精确的单细胞基因组测序和单元型分析[41]. 微流体装置由四个模块组成:单细胞捕获模块、细胞裂解与链分离模块、分区模块和扩增模块. 首先从细胞悬浮液中捕获单个细胞；随后捕获的细胞被裂解，双链染色体DNA分子被碱性溶液分离；之后分离的DNA片段使用旋转泵随机分布，并分割成24个相同的区室；最后每个分区被中和并下推到扩增模块中，由MDA进行扩增. 每个腔内的放大产物被检索，最终收集每个区室的扩增基因组DNA合并转换成条形码测序文库（barcoded sequencing libraries），并使用Illumina的合成短读测序进行测序. 利用冗余序列信息和基于单倍体型减少序列错误，平均 500 kb长的DNA片段可以组装成单倍体重叠群，测序结果错误率低至10-8，而且在更均匀的扩增和更准确的序列比对后可以进一步提高性能. 从单个细胞获得准确的基因组序列和单倍体信息将使得基因组测序的应用能够满足不同的临床需求. 10x Genomics作为单细胞领域的后起之秀，巧妙使用了Barcoding（条形码）和Microfluidics（微流体）技术，在单细胞分离、扩增原理上具有明显的优势. 与二代测序数据相结合，在Scaffold的组装上能够达到媲美三代测序的组装效果.

De Bourcy等[34]对MDA、MALBAC和PEP三种单细胞扩增方法作了定量比较，发现MDA的扩增均匀性与扩增产率成反比，而MALBAC和PEP则不明显. 当扩增产率高于106时，MDA的覆盖率最低；当扩增产率大于2.5×103时，MDA检测CNV效果较差；当扩增产率小于5×106时，3种方法的从头测序（de novo）拼接效果无差异. 聂等[42]发现，MDA技术不适合用于短串联重复序列（short tandem repeat, STR），等位基因缺失和伪等位基因严重，相比之下PEP技术分型准确率较高，但其对小片段的扩增偏倚性可能会导致大片段扩增失败. 在单细胞水平上对成纤维细胞样品进行低深度高通量测序，比较MALBAC和MDA这两种方法的染色体拷贝数变异（CNV）检测率和等位基因丢失率（allele dropout，ADO）的系数[43]. 结果CNV检测的成功率在MALBAC组为100％，在MDA组为91.67％，MALBAC组CNV检测的变异系数明显优于MDA组. 在MALBAC组中等位基因检测的总ADO率为4.55％，显著低于MDA组中观察到的22.5％. 当5个或更多个细胞作为初始模板时，MDA的ADO率显著降低，以致于这两种方法之间的差异变得不明显. 利用MALBAC和MDA两种WGA方法对β-地中海贫血基因分型和单核苷酸多态性进行CNV检测[44]，并统计分析了两种方法之间的扩增效率、阳性预测值、灵敏度和ADO值. 发现MDA的扩增率和ADO率均优于MALBAC，MDA的敏感性和阳性预测值均高于MALBAC，证实MDA比MALBAC更适合用于SNP检测. 然而，在单细胞水平上使用低深度NGS进行CNV检测时，MALBAC比MDA更稳定和均一. 因此MALBAC更适合于CNV检测，而用MDA对SNV检测会好得多. 谢晓亮教授团队[36]对比了LIANTI、MDA、MALBAC和DOP-PCR方法，结果表明，LIANTI扩增效率及均匀性是最优的，并且基因组覆盖率可达到97%，是目前CNV检测最准确的方法. SISSOR技术利用双链共有序列和长亚单倍体片段组装，同时提供比使用类似单细胞扩增和测序平台的其他技术更高的每碱基测序准确度和更长的单倍型. 长片段读取方法[45]通过比较来自许多细胞的多个单链文库的共有序列来减少错误，而SISSOR技术利用仅来自单个细胞的两个互补链的共识来进行错误校正，是迄今为止最精确的单细胞基因组测序[41]. 关于各种方法之间的简易比较我们列于表2中.

表2 主要的WGA方法比较

Table 2 Comparison of mainstream WGA methods