经典 ! PCR 条带弱 4 步排查法(看到就是赚到) |
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用微信扫码二维码 分享至好友和朋友圈 师兄救命!我最近在跑 PCR,已经连续两个礼拜不出条带了。 PCR 条带弱、甚至没有条带,其实总计只有 4 个原因,逐步筛查,就能跑出好条带,以下笔记好好收藏哦! 从 PCR 反应的关键环节入手,我们可以发现 PCR 经常会在「酶的质量」「引物」「mix」「反应体系与温度」上出现错误,因此原因也应该在这些环节基础上,进行分析排查。本篇内容来自「PCR 常见问题专题」,提前订阅专题好内容不错过! 订阅专题免费学 PCR 常见问题全解析 酶失活的原因 需要更新酶,或者新旧两种酶同时使用,分析是否因酶的活性丧失或不够二导致的假阴性。需注意,有可能是忘记加 Taq 酶或溴乙锭。 引物出现问题 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增的条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增。 mix 与镁离子浓度 镁离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体系与温度设置 通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20μL、30μL、50μL 或 100μL,应用多大体积进行 PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如 20μL 后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则容易失败。 变性对 PCR 扩增来说,也相当重要。如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 最后,靶序列发生突变或缺失,则会影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其 PCR 扩增是不会成功的。 以上就是 PCR 条带弱的 4 个常见原因以及排查方法,如果你觉得本文章有用,欢迎收藏、转发。如果你是师兄师姐,也欢迎把本篇文章分享给师弟师妹们! 更多实验问题 点击进入丁香实验小程序 策划|Olaf 配图|丁香实验设计团队 特别声明:以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布,本平台仅提供信息存储服务。 Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services. /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端 |
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