【实验技术笔记】RNA 抽提 + 反转录PCR + PCR引物设计 + RT

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【实验技术笔记】RNA 抽提 + 反转录PCR + PCR引物设计 + RT

2024-06-05 00:29| 来源: 网络整理| 查看: 265

文章目录 1. RNA 抽提 2. 反转录 PCR (rtPCR) 3. PCR 引物设计 4. RT-qPCR

1. RNA 抽提

TRIzol 作用原理

在这里插入图片描述

● TRIzol 法的优点：

快速能抽提多种属总 RNA 对少量的组织和细胞以及大量的组织和细胞都能有效分离能抽提不同分子量大小的多种 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染抽提出来的 RNA 适用于多种实验

RNA 抽提前的准备

● 试剂耗材准备：在这里插入图片描述

● 样品准备：在这里插入图片描述

RNA 抽提流程

在这里插入图片描述 ● RNA 抽提操作

氯仿抽提： ◆ 每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿，用手大力摇管 15s，室温孵育 2-3min；（使氯仿和 TRIzol 充分混匀，不能用振荡器，否则容易使 DNA 的亲水基团与水相接触，造成 DNA 污染） ◆ 4°C 离心 12000g × 15min。（离心后，DNA、蛋白质混合物分离为下层红色的有机相、中间相以及上层无色水相，RNA 存在于水相。）取水相：转移 400ul 水相到新管。（转移水相时，枪尖随着液面下移而下移，避免扰乱白色分层，慢慢吸取，避免吸到中间相和下层有机相，不要贪心吸太多，吸大约 400ul 就好。）异丙醇沉淀： ◆ 加入 600ul 异丙醇上下颠倒混匀 10 次，室温孵育 10min（使核酸沉淀下来，分离盐类杂质），或者 4℃或-80℃孵育 1-2h；（低温沉淀能提高核酸沉淀效率，当核酸浓度很低时用低温沉淀效果明显；如果核酸样品比较脏，会大大增加杂质被同步沉淀的几率，不建议使用低温沉淀以及沉淀时间过长） ◆ 4°C 离心 12000g × 10min。（往往离心前 RNA 不可见，离心后在管侧面和底部形成白色沉淀。）乙醇清洗：弃上清，轻轻加入 1ml 75%乙醇洗涤一次，4°C 离心 7500g × 5min。（加入 75%乙醇时让 RNA 沉淀轻轻漂起来，或者保持原位，因为有时候 RNA 太少，吹散了再离心下来时 RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可见的沉淀，导致后面的“盲操作”。）晾干沉淀后溶解：尽量吸除上清，室温干燥 5-10min，以 DEPC treated 水溶解，-80°C 保存。（密切注意 RNA 沉淀的干燥程度，不要完全干燥，这将大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值会偏低。最佳干燥度为 RNA 沉淀微微湿润呈啫喱状。）

RNA 质量检测

1、分光光度计测定：Nanodrop 2000、Agilent 2100

RNA 在 260nm 处有最大吸收峰，通过测定样品的 OD260、OD280，可以估计样品的含量和纯度。OD260 为 1 的溶液含有 40ug/ml。纯的 RNA 其 OD260/OD280 应为 2.0，如果比值偏小，则有机溶剂或蛋白污染较严重。如果比值偏大，则 RNA 可能已发生降解。以吸光度值估计 RNA 含量和纯度并不十分可靠。需要结合其他方法综合判断。

2、凝胶电泳法：

配制 1.2% 琼脂糖凝胶。将样品加上 RNA loading buffer 后加入上样孔电泳。电泳液用新鲜的 1×TAE 即可。 ◆ RNA loading buffer 配方：在这里插入图片描述

紫外下拍照可以看见 3 条带，从上往下依次是 28s RNA、18s RNA 和 5sRNA。其中 28s RNA (5kp) 应为 18s RNA 亮度的 2 倍且没有涂抹状条带，这样的 RNA 质量是过关的。

吸光度测定法来不能区分 DNA 和 RNA，而电泳法如果看到上样孔内亮亮的，那通常为污染的 DNA。如果 DNA 会干扰后续实验，可以用 DNase 消化去除。

可以通过与 marker 比较估计 RNA 含量。(marker 通常会告诉上多少量的 marker，最亮条带相当于多少量的 DNA，例如 DNA marker 最亮条带是 1ug，上样量约 1.5ug, 因此将 RNA 条带亮度与 marker 对比，可大概得知 RNA 的量。）在这里插入图片描述

2. 反转录 PCR (rtPCR) rtPCR：检测 RNA。在这里插入图片描述

01 反转录

反转录实验原理：在这里插入图片描述

根据不同情况

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