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作者 | 刘晓丽

单位 | 河南省人民医院检验科

前 言

三年新冠大流行终于要接近尾声了，检验人的核酸检测工作远没有到说结束的时候，近三年来频繁的新冠核酸普筛工作使民众对这个项目耳熟能详，在抗疫期间，全国不同地区不时出现新冠核酸检测结果时阳时阴的情况，导致民众的各种猜测及政府公信力不断遭到质疑。随着防疫政策的改变，从2022年12月截至到2023年2月，我国几乎高达85%以上的民众遭受了新冠病毒的感染[1]，导致大量的患者涌入医院。目前在临床治疗过程中又出现“阴晴”（阳-阴-阳-阴）不定核酸结果，核酸检测结果又遭到临床医生的质疑？因此就实际工作中出现的多例新冠病毒核酸检测“阴晴”不定的结果进行探讨，揪出“内鬼”还检验医生以清白。

案例经过

患者一， 女，70岁，间断发热、咳嗽12天，胸闷5天，12天前无明显诱因出现发热，最高体温38.5℃，自行口服退热药物可以降至正常，但易反复，伴咳嗽、咳痰，无胸闷、无乏力，5天来患者开始出现胸闷、乏力，伴咳嗽加重、间断咳白痰，伴纳差，于某院多次完善胸部CT检查均提示肺炎，给子“左氧氟沙星、哌拉西林他唑巴坦”治疗12天，效果差，2天前复查胸部CT提示双肺多发感染，部分实变，主动脉及冠脉壁多发硬化，给予丙种球蛋白治疗4天，并自行口服奈码特韦片2天，效果差，仍发热、咳嗽、胸闷。

现患者为行进一步诊疗入我院，门诊以“肺部感染”为诊断收入我科，新冠核酸检测阳性，根据症状、体征及辅助CT、核酸结果，诊断:1、肺部感染2、高血压（高血压病史2年）。给以止咳、化痰、平喘、护胃、营养心肌，雾化，激素等药物对症支持治疗;后期复查胸部CT。从2023-1-9号2023-2-10共做6次CT、11次新冠核酸检测，1月26日新冠核酸阴性，CT示：双肺炎症，1月20日开始CT的结果较前减轻，1月29日结果完全好转，仅有少量片状阴影，而新冠核酸结果从1月26日以后时阴时阳引起临床的质疑。

患者二，男，40岁，间断发热伴呼吸困难40余天，加重2天为主诉入院，40余天前受凉后出现发热，最高39.5℃，伴纳差、乏力，无咳嗽、咳痰，无恶心、呕吐，无腹泻、腹痛等症状;自查“新冠抗原阳性”，遂就诊于当地诊所，给予药物(连花清瘟胶囊、阿莫西林、中药)治疗后好转;患者自行口服“巯嘌呤1片每天一次”（急性B淋巴细胞白血病），后再次出现发热，最高体温38.5℃，遂就诊于“某中医院”，CT检查可见双肺多发渗出性改变，诊断为“双肺肺炎”，给予抗生素、激素等治疗，症状稍好转出院。

出院后反复出现胸闷气短、呼吸困难、乏力症状，至某医院，给予鼻导管吸氧、雾化祛痰、抗炎等药物治疗，效果差。遂就诊于我院呼吸重症RICU病区，查新型冠状病毒核酸“阳性”。给予“高流量吸氧、抗感染、激素抗炎、奈玛特韦/利托那韦抗病毒”等治疗，好转后出院。至某院血液科继续治疗，症状持续改善，可间断下床活动。

2天前患者无明显诱因出现发热、胸闷，体温最高38.4℃，伴气喘、呼吸困难、乏力，伴口干、食欲下降，伴咳嗽、咳痰，为中等量白粘痰，血氧饱和度波动在70%~85%，CT检查提示双肺感染、右肺为著(未见纸质报告)，给予吸氧、抗炎退热等对症治疗后效果差。今为求进一步诊治至我院就诊，以“重症肺炎”为诊断收入我科。

患者自发病以来，神志清，精神差，睡眠、饮食差，近两天大便未排、小便正常，体重近期无明显变化。“急性B淋巴细胞白血病”病史3年余，于某院规律化疗治疗，效果尚可，现停药。该患者从第一次新冠抗原阳性到入我院中心ICU已有40余天，持续时间较长，我院第一核酸结果1-19号阳性，但核酸的ct值较高已达到30，2-10号转阴，后续又出现转阳。

案例分析

我们先来看看下图这两个“阴晴”不定的病例核酸检测结果，病例1（核酸结果见图1）患者初次入院核酸检测阳性是2023-01-09明德试剂检测的N/ORF基因的CT值均为21左右（见表1），随着治疗时间的延长N/ORF基因的CT值越来越高，到2023-01-17号N/ORF基因的CT值高达35左右，伴随着治疗进展患者体内的病毒载量越来越低。

2023-01-23号N/ORF基因检测转为阴性，2023-01-26号仍然为阴性，2023-01-30核酸检测N/ORF基因又转为阳性，由于检验报告没有报告CT值，临床大夫电话咨询，患者已经连续两次核酸检测转阴了，并且患者的临床表现及肺部CT均明显好转，1月30出院前核酸结果为什么又转阳了？和临床表现有预期差，并质疑了1月23号至26号检测结果是否准确？病例2核酸检测结果见（图2），同样也是先阳-阴-阳-阴的模式遭到临床医生的电话质疑？核酸检测的CT值（见表2）

图1 病例1的新冠病毒核酸检测结果

图2 病例2的新冠病毒核酸检测结果

表1 病例1的新冠病毒核酸CT值检测结果

表2 病例2的新冠病毒核酸CT值检测结果

要理清新冠核酸检测“时阴时阳”的结果，首先我们要了解新冠核酸检测的原理及影响因素。核酸即为生物的遗传信息物质[2]，包括核糖核酸核糖核酸（Ribonucleic Acid，缩写为RNA）和脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，缩写为DNA）。

根据病毒基因组核苷酸分子不同分为DNA病毒和RNA病毒，新型冠状病毒基因组为单股正链RNA[3]。新冠病毒的核酸检测即用荧光定量RT-PCR技术检测新型冠状病毒的N基因和ORF基因，荧光定量RT-PCR是目前最常用的新冠病毒核酸检测方法也是确诊新冠感染的金标准[4]，

检测原理：先采用RT-PCR技术将新冠病毒的核酸（RNA）逆转录为对应的脱氧核糖核酸（DNA）；再采用荧光定量PCR技术，将得到的DNA进行大量复制，同时，使用特异性探针对复制得到的DNA进行检测，如果存在新冠病毒核酸，仪器就可以检测到荧光信号，而且，随着DNA的不断复制，荧光信号不断增强，这样就间接检测到了新冠病毒的存在（如图3）[5]。

图3 新冠核酸检测示意图

影响因素：核酸检测qPCR方法具有速度快、批量化、价格低等优势，然而影响因素也很多,如扩增反应抑制物、扩增仪孔间温度的差异以及核酸提取中的随机误差,均可造成假阴性结果的出现[7]，排除这些实验室影响因素，恐怕大多数患者出现“时阴时阳”的结果应该考虑样本因素了。

新冠感染的途径主要为呼吸道传播，新冠病毒主要依靠其表面的S蛋白上的受体结合域（RBD）识别宿主细胞受体血管紧张素转化酶2（ACE2），并与之结合感染宿主细胞[6]。第十版的诊疗方案中也明确了核酸检测标本:呼吸道标本(鼻咽拭子、口咽拭子、痰、气管抽取物)或其他标本中的新冠病毒核酸。所有患者血液样本的检出率较低，目前几乎所有市面上的检测试剂盒主要检测呼吸道样本。很多专家从实践工作中总结出的经验认为：鼻咽拭子标本核酸阳性率高于口咽拭子,下呼吸道痰、气管抽取物样本核酸阳性率高于鼻咽拭子、口咽拭子[8]。

经历多次“阴晴”不定的案例，本室积极寻找答案，每次遇见“阳-阴-阳-阴”的标本，先排除核酸提取、核酸抑制物、仪器等没有问题，室内质控在控，对和历史结果不一致的标本进行双试剂复核，结果依然如此。

排除实验室各项人为、环境、试剂等因素外，最大的可能出现在标本上。新冠标本主要采用的是鼻咽拭子和呼吸道分泌物，内参为上皮细胞的管家基因，只要内参起跳S型曲线，室内阴阳质控在控，基本上判定实验结果是可靠的。

但呼吸道标本的病毒不像血液样本病毒分布均匀，当病毒载量较低时，如果采集的上皮细胞较少或者感染病毒的上皮细胞较少，很容易导致扩增阴性，而后1-2天再次进行核酸检测又检出阳性，这种阳性结果从表-1、2中发现：N/ORF基因的CT值均大于35，有的高达37（CT值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数）。

CT值与起始模板的关系：每个样本的CT值与该样本模板的起始拷贝数的对数存在线性关系（见图4），起始拷贝数越多，CT值越小，反之CT值越大，说明这种转阳并不是患者的复阳，多数是患者康复期病毒载量较低，而之前的阴性很可能是因为采集到核酸样本带病毒量较少，起始模板量少导致扩增阴性，而后的转阳也是临界值附近，可能采集到的病毒量相对前面阴性的标本量多而已，但CT值均大于35，临床上根据国务院联防联控第9版标准，该患者已不具备传染性了。

图4 核酸检测CT值和模板的关系

小 结

新冠的治疗，临床上也越来越重视患者核酸检测结果的CT值，随着抗病毒治疗、患者的康复，大量的病毒被清除，体内病毒载量显著降低。因此在新冠康复期患者核酸结果出现会出现“阳-阴-阳-阴”的反复，多与采集的样本带病毒量多少有关，这主要由于鼻咽拭子及呼吸道分泌物样本内病毒量不均一性造成的，导致新冠核酸检测不如其他血液样本（像乙肝、丙肝病毒核酸检测）结果稳定。

由于新冠样本的特殊性、且影响采样的人为因素较多，容易导致康复期患者出现“阴晴”不定的结果。检验医生通过排查实验流程、复查、及历史CT值的比较，从检测原理、实验室影响因素、样本采集几方面积极和临床沟通，使临床医生对患者体内新冠病毒载量有个更清晰的认识，并和采样护理人员进行沟通，对恢复期患者的核酸采样一定要更加谨慎、采样更加规范，避免假阴、假阳的出现。

专家点评

赵静 主任技师 河南省省人民医院检验科pcr室负责人

实验室从面对临床的质疑，积极排除各种PCR扩增的影响因素，力寻真相，通过CT值的分析，为临床提供合理的答案。根据这一影响因素积极和临床护士进行交流培训，加强采样规范的学习，大大减少了这种新冠康复期患者“阴阳”不定的结果，为临床提供了更准确的实验室信息，为患者的康复贡献检验医生应有的力量。

参考文献

[1]中国疾控网.全国新型冠状病毒感染疫情情况,2023-02-18.

[2]周春燕,药立波．生物化学与分子生物学[ M]．第九版．北京：人民卫生出版社，2018：196-197页

[3]王娜,叶飞,翟德胜,谭文杰,赵营.新型冠状病毒反向遗传学技术应用进展研究[J].国际病毒学杂志,2022,29(2):159-162.

[4]上海市医学会检验医学分会.新型冠状病毒核酸和抗体检测临床应用专家共识[J].国际检验医学杂志,2020,41(14):1665-1669.

[5]王成彬.核酸检测用于确诊新型冠状病毒肺炎阳性率低的原因分析[J].中华医学杂志,2020,100(13):961-964.

[6]许可欣,彭南求.SARS-CoV-2受体(ACE2)相关感染致病机制的研究进展[J].首都食品与医药,2022,29(1):11-17.

[7]张瑞,李金明.如何减少新型冠状病毒核酸检测的假阴性[J].中华医学杂志,2020,100(11):801-804.

[8]陈炜,张春阳,朱颖,张炎华,游丽斌,吴冰珊,黄枝妙,郑奎城,翁育伟.4例新型冠状病毒感染病例咽拭子与痰标本病毒核酸检测的比较[J].中国人兽共患病学报,2020,36(5):354-358.

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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼

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