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2023年4月25日/医麦客新闻 eMedClub News/--近年来，随着重组腺相关病毒 (rAAV) 载体广泛应用于体内基因治疗，其相关工艺研究样品的分析表征和质量控制越发受到审评机构重视。例如在 AAV 产品的临床用药安全和有效剂量研究中，样品的精确量化是数据分析的基础，关键质量控制包括滴度检测、纯度分析、靶序列鉴别等。病毒的基因组滴度是一个关键质量属性，同时也是临床给药量的重要基础，因此需要采用准确度较高的方法进行基因组滴度的检测。

目前检测基因组滴度常用的方法主要有 QPCR 法和 ddPCR 法。QPCR 法为相对定量方法，检测中需要采用标准品制作标准曲线，基于标曲计算基因组滴度，然而标准品的构型、稳定性、扩增位点等因素均会影响检测结果的稳定性和准确度。尽管可以在官方机构（如 ATCC）处购买到血清型2或者血清型 8 的 rAAV 质粒 DNA 标准品，但如何获得具有代表性的标准品，依然是行业共同的难题。

ddPCR 检测 rAAV 基因组滴度

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ddPCR(droplet digital PCR) 技术的萌芽与发展给上述问题带来了解决方案。ddPCR 技术在 PCR 扩增前对样品进行微滴化处理，将含有待测样品的反应体系分成上万个纳升级的微滴。通过 PCR 仪对靶基因进行扩增和信号放大，再使用微滴分析仪根据检测通道对液滴逐个进行荧光检测。根据泊松分布原理及阴阳性微滴的分析，即可实现靶基因的起始拷贝数或浓度的测定。由于不需要标准曲线，ddPCR 方法被称为是绝对定量方法，可以避免使用 qPCR 进行 rAAV 基因组滴度检测的标准品相关问题，准确性更好。此外，就检测的批内和批间精密度而言，ddPCR 在检测 rAAV 基因组滴度方面也优于 qPCR，并且对样本或制剂含有的潜在反应干扰物具有更强的抗干扰能力，检测灵敏度可以达到 10 copies/ 反应或更低。

除了在绝对定量上得天独厚的优势，使用 ddPCR 对同一 rAAV 样品的不同位点进行标记，还能够实现 rAAV 样品的基因组完整性分析。如果可以进一步证明 rAAV 的完整基因组滴度与 rAAV 样品转导活性的关系，甚至能够将 ddPCR 方法发展成为转导活性检测的替代方法。

ddPCR 在细胞治疗产品和 mRNA 中的应用

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除了在 rAAV 上的应用，ddPCR 的检测手段也可以应用在细胞治疗产品和mRNA的质量控制上。在细胞治疗产品中，Car 细胞拷贝数/插入基因阳性率对于治疗效果也是非常关键的质量属性，通过设计靶标基因和内参基因，使用 ddPCR 技术对 2 个基因进行绝对定量，避免标准曲线校准及扩增效率的影响，CAR 拷贝数结果准确度高，重复性好。并且也可以直接将细胞进行液滴包裹，形成单细胞的液滴，通过 PCR 扩增和液滴的信号收集，从完整细胞的角度进行插入基因的分析，获得细胞样品的插入基因阳性率检测结果，与 CAR 拷贝数检测一同在基因水平进行转导效率的研究，同时与蛋白水平流式细胞荧光分选技术（FACS）共同分析，可更好的支持工艺开发与优化，保证产品的有效性。

ddPCR 技术不仅在 AAV 和 Car-T 产品中具有广泛的应用，而且在质粒、活菌和 mRNA 等产品的质量分析中也扮演着非常重要的角色。Bio-Rad 与博腾生物合作，在 ddPCR 分子检测平台上成功开发出多种运用于rAAV、细胞产品（如Car-T、MSC）、mRNA、质粒和活菌产品的检测方法，在 ddPCR 分析方法开发和验证上具备充足的经验。

博腾生物分子检测平台 ddPCR 应用案例分享

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标准品定量及 AAV 基因组滴度检测

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图1为标准品梯度稀释试验，结果表明定量限可低至 20 拷贝/反应，检测限可至 5~10 拷贝/反应，ddPCR 方法能更好的用于标准品的定量和残留检测。

图2为 AAV 基因组滴度检测的代表性图谱，通过对 AAV 样品的前处理，再通过 ddPCR 系统进行液滴生成并进行 PCR 扩增后读取液滴信号，结果表明使用 ddPCR 对病毒滴度进行检测，其结果阴阳性区分明显，易于分析，结果准确，并且相同样品不同天检测 CV 值 ≤10%。

插入基因阳性率 /CAR 拷贝数检测

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表1. 细胞完整率及插入基因阳性率汇总表

图3为插入基因阳性率检测的代表性图谱。通过加入细胞样品生成液滴实现液滴包裹细胞后进行检测，结果表明使用 ddPCR 方法对细胞进行检测时，细胞完整率高，干扰少，阳性率结果准确、稳定，细胞完整率 ＞97%。

图4 为 CAR 细胞拷贝数检测的代表性图谱。通过设计特异引物进行扩增，由图4可看出，各信号团聚团，无散点，易于分析，结果稳定可靠。

mRNA Poly A 尾完整性分析

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图5. mRNA Poly A 加尾率

表2. mRNA Poly A 加尾率分析数据汇总

图5为 ddPCR 方法分析 mRNA Poly A 加尾率的代表性图谱。将 mRNA 分子进行液滴包裹，通过不同区域液滴占比，以及数据分析，计算出带有 Poly A 的 mRNA 和总 mRNA 数量。由结果分析，阴性样品无干扰，Poly A 尾检测专属性好，特异性强。并通过不同类型样品混合进行加标回收率实验，方法加标回收率在 70%~130% 之间，结果准确可靠。

关于Bio-Rad

Bio-Rad Laboratories, Inc.（NYSE: BIO 和 BIOb）是面向生命科学研究和临床诊断市场开发、生产和推销一系列创新产品的全球领先企业。在过去的 70年多里，由于我们始终将质量和客户服务视为第一要务，我们的产品加速了发现进程并促进了医疗保健行业的发展。我们的客户包括大学和研究机构、医院、公共卫生和商业实验室、生物技术和制药公司以及研究食品安全和环境质量等的应用实验室。Bio-Rad 成立于 1952 年，总部位于加利福尼亚州赫拉克勒斯，运营网络遍及全球，全球员工共计超过 8,300名。2022 年，Bio-Rad 的年营收超过了 28 亿美元。请参 阅 bio-rad.com 以获取更多信息。

关于博腾生物

苏州博腾生物制药有限公司成立于2018 年12月，立足于苏州工业园区，以上市公司-重庆博腾制药科技股份有限公司（股票代码：300363）为依托，搭建了质粒、细胞治疗、基因治疗、溶瘤病毒、核酸治疗及活菌疗法等CDMO平台，提供从建库，工艺方法及分析方法开发，cGMP生产到制剂灌装的端到端服务，贯穿药物不同研发阶段，帮助客户加快药物研发与上市进程。

博腾生物聚焦基因与细胞治疗，在博腾股份的成功经验之上，以国际一流的专业人才为核心，秉承“客户第一”的服务宗旨，以“合规、专业、专注、开放协作”为品牌理念，延续母公司强大的IP保护和项目管理机制以及完善的质量管理体系，充分利用核心团队将基因和细胞治疗产品推向临床直至上市的成功经验，为全球客户提供优质和高效的服务，让好药更早惠及大众。

博腾生物基于丰富的CMC药学研究与成功经验，以客户需求为导向，现正式对外提供分析检测与咨询服务，为有分析方法开发、检测和咨询需求的企业提供支持。

博腾生物基于丰富的CMC药学研究与成功经验，以客户需求为导向，开发了针对质粒、病毒、细胞、mRNA及活菌等不同种类GCT产品的系统化平台检测方法，截至目前已超过300项。如需300+项平台检测方法清单，也可点击“阅读原文”，并填写表单信息，审核通过后我们将会发送给您。

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