|
我用的是PET28b＋载体，表达的蛋白为18KD,为何我用不用IPTG诱导，其表达量都没有太大变化呢？（不诱导的时候表达也挺高的）我该如何分析？有一种说法我记得叫渗漏，就实在不加IPTG诱导时，由于培养基或者菌种本身可以产生类似乳糖的结构，诱导了表达 不过还是应该做好对照仔细判定一下是否是这种情况，表达量没变化但是蛋白是否有变化还是应该Western确证一下的 祝好运！ SmallDonkey 说的对,你可以尝试加点葡萄糖.可能你的培养基有问题,我也遇到过这种情况!SmallDonkey状态更新了啊，恭喜恭喜呵呵请问版主最后问题解决了吗？我也遇到了同样的问题，不加IPTG诱导是表达量也很大，与诱导后的表达量差不多。请问版主最后问题解决了吗？我也遇到了同样的问题，不加IPTG诱导是表达量也很大，与诱导后的表达量差不多。shichangjie2006 wrote:请问版主最后问题解决了吗？我也遇到了同样的问题，不加IPTG诱导是表达量也很大，与诱导后的表达量差不多。这种表达就是所谓的本底表达，对于pet系列的表达系统，即使在没有IPTG 存在的情况下，也会有少量lacUV5 启动子表达的T7 RNA聚合酶，因此存在目的蛋白的本底表达。如果想抑制本底表达，对于pET系统你可以根据目的蛋白的特点，通过选用T7/T7lac 启动子，pLysS或pLysE宿主菌，以及培养基外加葡萄糖等方法严紧控制蛋白表达水平。对于加入IPTG前后表达量差不多的问题，可能是加入的IPTG的时机不对，如果加入IPTG时还有足量的葡萄糖，这时会抑制乳糖操纵子，限制目标蛋白的表达；还有可能是加入的IPTG的量不够，没有充分诱导，对于带普通T7 启动子的pET 重组子，终浓度为0.4mM 的IPTG 可以实现完全诱导，而带有T7lac启动子的载体则需要终浓度为1mM 的IPTG 才能完全诱导。
|