下载目标基因 SETD3(human) CDS 序列文件： NCBI-gene 中搜索 SETD3 → 点击 人源 SETD3 基因→点击 NCBI Reference Sequences (RefSeq) → 点击 转录本 NM_032233.3 → 下拉页面点击 CDS → 点击 FASTA → send to (选择Complete Record, File, FASTA, Create File) 保存到本地 SETD3.fasta 。

下载 pEGFP-N1 质粒文件：打开 Snapgene官网 → 搜索质粒 pEGFP-N1 → 点击 Download Plasmid 下载质粒文件 pEGFP-N1.dna 。 ● 载体的选择：根据构建DNA重组体的目的（克隆扩增/表达），选择合适的克隆载体/表达载体。pEGFP-N1载体 ● 参考资料：基因操作中该如何选择载体？

筛选不切质粒的酶切位点：用 Snapgene 打开质粒文件 → Ctrl+A 全选质粒，点击 Enzymes 菜单，选择 Noncutters（无切点内切酶），选定酶 NheⅠ和 KpnⅠ。

确定载体和目的片段中的没有被选定的酶切位点：Ctrl+E 选择酶，勾掉隐藏无切点内切酶，输入要选的酶，例如 NheⅠ和 KpnⅠ，添加，确定无选定的酶切位点即可。

设计上游引物 Forward（Top Strand, 5’）：确保目的基因前面有 ATG 起始密码子，选择约 15-30bp 的 5’端序列，退火温度 55-60℃；前面加 Kozak 序列（GCCACC AUG G），提高转录翻译效率；Kozak 序列前面添加上游酶切位点；酶切位点前再加保护碱基。5’-保护碱基-上游酶切位点/同框碱基-Kozak 序列-上游引物-3’

◆ 注意：尽量保证上下游引物总长度在 20-30bp，GC 含量 40%-60%，Tm 值尽可能相同或接近（55-60℃）。参考：引物设计原则 ◆ 也可以先通过 Primer3web version 4.1.0 设计上下游引物，再加酶切位点和保护碱基。详见教程： Primer3web 在线引物设计–2 分钟学会步骤极简的引物设计！

设计下游引物 Reverse（Bottom Strand, 3’）：选择约 15-30bp 的 3’端序列，退火温度 55-60℃，确保没有终止密码子；前面添加上游酶切位点（后面补齐碱基保证同框）；酶切位点前再加保护碱基。5’-保护碱基-下游酶切位点/同框碱基-下游引物-3’ ◆ 加引物：选中合适的引物段 → Primers 菜单 Add Primer (Ctrl+R)

加酶切位点-保护碱基&同框 ① 加酶切位点：需要在多克隆位点 MCS 中选择合适的酶切位点插入目的基因，找不切目的基因的酶切位点，与所选质粒的 MCS 中的酶切位点取交集，并保证两种酶在同一酶切 Buffer 中活力 Activity > 50%。 ● 查看酶活：双击酶切位点，即可查看选定酶切缓冲液中酶的活性。 ② 加保护碱基：酶切位点前添加酶切位点 3-4bp 保护碱基（保护喊基有表格可以查，不同酶切位点对应不同碱基），有利于内切酶识别和结合序列。 ◆ 常用酶切位点表(含保护碱基) 如：NheⅠ加 5’-CTAGCTAGCTAG-3’，KpnⅠ加 5’-CGGGGTACCCCG-3’。

◆ 加酶切位点-保护碱基-同框。也可以按需选择插入Kozak序列（GCCACCAUGG）、密码子或标签序列（Peptide coding sequence） 。 ③ 同框：目的基因要与后面的 EGFP 绿色荧光蛋白（也可能在 MCS 前面，根据所选质粒载体来判断）形成融合蛋白一起连续翻译出来，所以需要同框（中间不能有终止密码子），在设计引物前需要检查并删除终止密码子；此外，下游酶切位点切割后也要保持同框，如果切割后，从酶切位点到 EGFP 的碱基数不是 3 的整数倍，需要在引物中的酶切位点前面加碱基补齐，防止移码突变。 ◆ 删除终止密码子：TAA/TAG/TGA。点击左侧显示翻译 (show translations) 按钮，即可显示序列中有无终止密码子（* 星号表示），选中后 delete 删除。 ◆ 同框：如图，下游酶切位点到 EGFP 标签之间有 28 对碱基，需在酶切位点前加 2 对碱基（根据引物GC含量/Tm值选择），使插入片段与 EGFP 同框，抵消移码突变。

测试上下游引物能否扩增出目的片段：按住 Shift 选中目的片段的上下游引物 → 点击Actions 菜单 选择 PCR → 点击 PCR，即可看到扩增产物，Ctrl+S保存。

将目的基因插入质粒构建重组质粒：选择质粒文件，点击 Actions Insert Fragment → 选中质粒的上下游酶切位点 → 选中 Insert ，导入之前保存的扩增产物文件 → 选中目的基因上下游酶切位点 → 右下角设置文件名 SETD3-pEGFP-N1.dna → 点击 Clone。

保存克隆载体图谱：按住 shift 选中克隆载体的 NheⅠ和 KpnⅠ → 选择 Features 菜单中的 Add Feature （Ctrl + T）→ 设置插入片段名称和颜色 → 点击 File 选择 Export Map 保存克隆载体图谱 SETD3-pEGFP-N1 图谱.png。