几番摧残,科研小白终于注意到提取 RNA 的这些操作细节! |
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刚开始 Trizol 法提 RNA OD 值 260 / 230 要么太低(1.4 - 1.6),要么太高(2.1 - 2.2),一段时间的摧残过后,终于可以总结出一些操作细节供参考。 1. 举例 12 孔板 TAKARA RNAiso Plus(9109); 2. PBS 冲洗一遍,每孔加 Trizol,用 qiang 头「井」字法划孔底,并且吹打数次,收集到 EP 管中后重新吹打; 3. 离心后取上清用黄 qiang 头,控制速度慢吸,并且整个过程中 qiang 头保持在液面以下 0.5 - 1 mm; 4. 异丙醇离心完之后,有可能出现沉淀,有可能不出现,和细胞量有关,并且有些沉淀并不明显,表现为很透明的薄膜状,需要仔细辨别;弃异丙醇,我的 Trizol 说明书里面可以残留少量异丙醇,如果离心完可以观察到沉淀,我会蓝 qiang 头慢吸--白 qiang 头吸干,如果沉淀不明显,可以残留少量异丙醇; 5. 乙醇洗涤,沉淀会变明显,但由于洗涤的离心转速并不高、时间并不长,所以在弃乙醇的过程中,要比较慢的吸,否则可能误弃沉淀(尤其是半透明的沉淀); 6. 弃乙醇:蓝 qiang 头慢吸--白 qiang 头吸干;室温开盖 3 min,具体以沉淀变为半透明为准,一般 3 min 左右差不多; 7. 有些实验对 RNA 浓度有要求,可以 500ul trizol/孔,合 2 孔为一个 EP 管,溶解时加少量 DEPC 水(我一般用 20ul,若对浓度有要求会降到 10ul)。 8. OD 值结果: 太低---有机物污染:我的整个操作很注意无酶,但一段时间仍然有这个 bug,后来发现是乙醇没有弃干净,所以我的经验是要吸干; 太高---DNA 污染:加入氯仿离心后,上清液取的时候速度太快,后来控制了速度也改换了黄 qiang 头就好很多了。 具体方法: 12 孔板 1 ml Trizol/孔 1.PBS 冲洗一遍; 2. 加 Trizol 裂解,室温静置 10 min; 3. 200ul 氯仿,振荡器混匀,静置分层后 离心 12000 g 4° 15 min 4. 去上清,加 500ul 异丙醇,室温静置 15 min,离心 12000 g 4° 10 min; 5. 弃异丙醇,75% 乙醇(75% 无水乙醇+ 25% DEPC 水)洗涤,轻轻吹打使沉淀悬浮后离心,7500 g 4° 5 min; 6. 弃乙醇(弃干净),室温开盖 3 min; 7. DEPC 水溶解得 RNA。 作者:@卿亦清明 0704 |
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