Nature Methods:著名蛋白研究专家解析蛋白图谱 |
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生物通报道:蛋白质组是后基因组时代的研究焦点。蛋白质是生命活动的真正执行者,而对蛋白图谱的研究也由静态图谱进步到“临时”动态图谱,从单个蛋白图谱变成了多个蛋白相互作用多项图谱,多种蛋白作用图谱。 来自来自美国克里普斯研究院(The Scripps Research Institute,TSRI)Skaggs生物化学与化学生理学研究所(Skaggs Institute for Chemical Biology and Department of Chemical Physiology)的研究人员不仅在世界上率先展开了蛋白质活性表达谱(activity-based protein profiling, ABPP)的绘制工作,而且近期还发布了最新的哺乳动物细胞蛋白棕榈酰化(protein palmitoylation)图谱。 领导这一研究的是Skaggs生物化学与化学生理学研究所的Benjamin F.Cravatt,他曾获得2005年美国化学会国家奖,是一位著名的蛋白研究专家,其研究小组在世界上率先开展了蛋白质活性表达谱的绘制工作,这一工作的完成将对蛋白酶作用底物的寻找起到巨大的推动作用。 人类基因组计划揭示了基因组的结构,但对多数基因功能仍知之甚少。基因功能通常通过蛋白质实现,因此蛋白质组研究成为近年来生命科学研究的重点领域。蛋白质具有生物活性之前要经过基因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工及转运等多个复杂过程。其中脂质化修饰是一种重要的翻译后修饰形式,目前已知约有5种脂质共价修饰形式,其中100多种蛋白质发生棕榈酰化修饰,赋予蛋白质极其复杂的生理功能。 30年前蛋白质棕榈酰化修饰形式被发现,然而对其修饰酶的研究最近十年才有所进展。在酿酒酵母中首次发现蛋白质酰基转移酶(protein acyltransferase, PAT),由50个氨基酸残基组成,其序列特征为锌指样DHHC-CRD(半胱氨酸残基聚集域),类似Cys2His2锌指模体,常位于跨膜域(transmembrane domain, TM)TM2和TM3之间。但是至今仍未明确棕榈酰基团修饰识别模体,推测其保守序列为:C-x2-C-x9-H-C-x2-C-x4-D-H-H-C-x5-C-x4-N-x3-F(x为任意氨基酸) 。 最早用来研究棕榈酰化的方法是棕榈酸脂代谢标记法,通过监控动物体内[H]标记棕榈酸脂,脉冲追踪分析检测棕榈酰化率。由于信号敏感度低,常常影响低丰度蛋白质棕榈酰化修饰检测效率,另外此方法只应用于活细胞而且不能定量分析。由于目前修饰位点仍然不明确,只能通过突变已知Cys残基位点来验证,而这可能改变蛋白质整体结构进而影响其他潜在修饰位点,反而降低检测率。 近年来通过以放射信号更强的 [I]替换 [H],提高底物蛋白质质量,并结合光谱测定技术,逐渐提高检测效率。直到PAT的发现,才通过体外 [H] 标记棕榈酰辅酶A 检测PAT 活性 。以上方法是棕榈酰化修饰基本检测方法,实际应用中还需要优化,Budde等结合快速蛋白质液相层析法(FPLC)分离纯化酵母细胞膜PAT 和已知相应PAT 特异底物来验证膜蛋白PAT 活性。此方法中为更好纯化PAT,应用低浓度去垢剂DDM 保持酶活性,为防止非特异蛋白质干扰再次验证时应用2-溴代棕榈酸酯(2-BP)抑制酶活性,检测特异性较高,其优点还有可以区分修饰是其它酶催化还是自身催化。 近年来普遍应用的方法是脂肪酸酰基转换标记化学法-ABE法,这种方法较棕榈酸脂代谢标记法更易于检测。此方法应用 [H]-NEM(N-乙基顺丁烯二酰亚胺)或是含巯基特异亲和性物质的复合物,如生物素(biotin)-BMCC和易剪切生物素酰化物(biotin-HPDP)等,标记 NEM-羟胺处理后酰化位点暴露的Cys 残基游离巯基进行检测 。此方法高度敏感,特别是巯基特异复合物标记,检测灵敏度较高,不仅应用于活细胞,还可从冻存组织中提取蛋白质标记并且能定量分析,也可联合应用探针法标记和质谱技术分析。 但是这种方法此方法仍有缺点,如标记前蛋白质游离巯基未全部封闭,NEM- 羟胺处理后硫醚键未全部断裂以致棕榈酸基未全部解离和游离巯基未全部标记等,还要同时对照无羟胺处理组 ,若发现标记位点则为非特异污染如细胞膜蛋白质,若为酵母细胞膜,应用氯仿-甲醇沉淀纯化降低污染。 在这篇文章中,研究人员发现一种商业获得的化合物:17-octadecynoic acid (17-ODYA)可以作为原位化学探针,识别人类细胞中的棕榈酰化的蛋白,利用这种方法,研究人员发现了超过125种预期棕榈酰化的蛋白(见下表),包括G蛋白等,完成了一张棕榈酰化蛋白最新图谱。 Experiment 1 (n = 6) Experiment 2 (n = 5) Protein name Protein description 17-ODYA Palmitate 17-ODYA Hydroxylamine Proteins are listed according to highest total spectral counts identified in both experiment 1 and experiment 2, which compare 17-ODYA–labeled membrane particulate proteomes to palmitic acid–treated and hydroxylamine-treated controls, respectively. Spectral count data represent average values a Proteins with a consensus myristoylation site (N-Met-Gly). CANX Calnexin 95![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() ![]() 在这项研究之前,从酵母到哺乳动物筛选得到的棕榈酰化蛋白质也只有100 多种,各种PAT的功能及其底物仍不明确,通过这项技术方法,研究人员能发现更多的棕榈酰化蛋白,深入研究不仅可以丰富对蛋白质组学的认识,还可对某些疾病诊断治疗和肿瘤治疗等具有深远意义。 (生物通:万纹) 原文摘要: Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells S-palmitoylation is a pervasive post-translational modification required for the trafficking, compartmentalization and membrane tethering of many proteins. We demonstrate that the commercially available compound 17-octadecynoic acid (17-ODYA) can serve as a bioorthogonal, click chemistry probe for in situ labeling, identification and verification of palmitoylated proteins in human cells. We identified 125 predicted palmitoylated proteins, including G proteins, receptors and a family of uncharacterized hydrolases whose plasma membrane localization depends on palmitoylation. |
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