来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO，（https://xueqiu.com/9950954021/228838634）

#RNA疗法# #CDMO# #CMO# 

目前mRNA技术的应用仍处于科学前沿，在开发和生产过程中mRNA质量相关的监管法规和行业标准仍处于发展阶段。2020年NMPA发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》中，建议对DNA模板、mRNA原液及成品LNP-mRNA进行质量控制，包括mRNA的特有表征：加帽率、poly A尾长、模板DNA残留、双链RNA（dsRNA）残留等。

耀海生物现推出mRNA质量分析系列文章，以总结当前mRNA的质量表征方法。今天和大家分享加帽率的检测方法。Part 1将和大家分享加帽率的检测方法，后续内容包括mRNA的完整性与纯度、序列准确性、poly A尾、dsRNA残留等分析策略。

mRNA的帽结构可维持体内稳定性，促进蛋白的翻译。带帽结构的mRNA占比可影响mRNA的免疫原性和翻译效率，因此加帽率是mRNA疫苗或药物的关键质量指标。

加帽与未加帽的mRNA仅相差一个核苷酸（m7G），相对于完整的mRNA太小，难以区分。当前加帽率的检测思路为：采用酶切方式获得5’端加帽或不加帽的寡核苷酸序列，随后通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效液相色谱（HPLC）或液相质谱联用（LC-MS）等方法分离不同大小的寡核苷酸片段，从而定量评估mRNA的加帽率。

2016年诺华公司Beverly M等发表在Anal Bioanal Chem杂志的一篇文章，《Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS》，研究基于磁珠及RNAse H酶切，得到酶解后、带或不带帽结构的5’端寡核苷酸片段，使用液相色谱质谱联用（LC-MS）检测，对带或不带帽结构的组分进行质谱峰面积定量，从而得到5’加帽比例。该方法是当前工艺中常用的加帽率检测方法。

2022年，BioNTech公司Vlatkovic I等在Pharmaceutics发表文章《Ribozyme Assays to Quantify the Capping Efficiency of In Vitro-Transcribed mRNA》。该研究提出，由于RNase H切割位点的专一性不稳定，可能产生其他切割产物，影响结果的可靠性。为改善这一不足，Vlatkovic I等设计了5个核酶（ribozyme），可识别5’UTR特异位点并切割，得到5’端酶切片段。通过硅胶柱去除长链RNA后，纯化得到核酶和5’端酶切产物。随后通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或LC-MS分离/分析带或不带帽结构的5’酶切产物，从而计算加帽率。

一、基于RNase H的mRNA加帽率分析

体外转录（IVT）制备两种不同长度的mRNA（2.2 kb与9 kb）进行测试，其5’末端的前50个核苷酸序列相同，可使用同一种切割探针。使用两种加帽方法：牛痘加帽酶、ARCA（Cap 0）帽类似物。将制备得到的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳，确认mRNA的长度和完整性。

退火反应体系包括500 pmol RNase H探针（生物素标记）、10×RNase H缓冲液和100 pmol mRNA，使用5倍量的探针以保证全部mRNA与探针结合，500 pmol是与磁珠结合的的探针最大量。反应条件为：将探针与mRNA混合，在95℃退火5 min，随后以2 min的间隔降至65℃、55℃、40℃，最后降至22℃。

磁珠结合与酶切

①结合：将退火的mRNA和探针加入预处理过的链霉亲和素磁珠中，室温孵育30 min。加入50 U RNase H，吹打混匀后在37℃下孵育3小时，然后置于磁力架，弃上清。

②清洗：用含1M NaCl的清洗缓冲液（5mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, pH7.5）洗涤3次以去除酶、mRNA和反应缓冲液；然后用蒸馏水洗涤3次以除去过量的盐。

③洗脱：加入75%甲醇（80℃预热），于80℃孵育1 min洗脱mRNA酶切片段。

④换液：通过旋转蒸发干燥洗脱产物，重悬于含1%甲醇的0.1 mM EDTA溶液，用于LC-MS分析。

                       图1: 基于RNase H与磁珠，mRNA 5’端寡核苷酸的捕获

LC-MS分析

使用液相高分辨质谱联用仪，固定相为ACQUITY UPLC C18色谱柱，流动相A为200 mM六氟异丙醇+8.15 mM三乙胺（pH 7.9），流动相B为100%MeOH。洗脱条件为：5%B洗脱1min，1-12 min内B浓度由5%线性增加到25%，然后90%B冲洗1min后恢复5%B。紫外波长设置为260 nm。

LC-MS分离效果

与含有二磷酸、三磷酸或未甲基化G cap（GpppG）相比，含有甲基化M7GpppG帽结构的切割片段，其质量差异有助于加帽率的鉴定。如图2所示，借助反相色谱柱进行液相-质谱分析，可有效分离Cap 1与未加帽的三磷酸mRNA切割片段。除预期的寡核苷酸片段外，还存在RNase H第二个识别位点及生物素探针，生物素探针的出现可能是由于洗脱条件苛刻。

         图2: 基于RNase H的加帽率分析. 上图为总离子色谱图; 下图为电喷雾质谱.

如上所述，文章介绍了一种定量分析mRNA加帽率的方法，且不需放射性同位素标记。该分析方法基于链霉亲和素磁珠特异性捕获生物素标记的探针，mRNA 5’端序列与探针结合，从而被RNase H识别并切割，经过清洗、洗脱得到mRNA 5’端单链寡核苷酸序列。然后通过LC-MS分离带或不带帽结构的寡核苷酸，从而得出mRNA的加帽率。

星耀小TIP：

2022年美国药典（USP）制定的《mRNA疫苗质量分析方法》草案中，基于RNase H切割作用，推荐RNase H与离子对反相高效液相色谱（IP-RP-HPLC），用于mRNA加帽率的测定：①使用RNase H特异性切割mRNA，以产生带或不带帽结构的5’端单链寡核苷酸序列；②通过IP-RP-HPLC分离寡核苷酸，使用C18柱、流动相A（0.1 mM冰醋酸三乙胺缓冲液pH 7.0），流动相B（A+25%乙腈）；③根据带帽结构的寡核苷酸的峰面积占比计算加帽率。

二、基于核酶的mRNA加帽率分析

体外转录（IVT）制备不同长度的mRNA（100 nt至9.4 kb），使用两种加帽方法：牛痘加帽酶、ARCA（Cap 0）或CleanCap（Cap 1）帽类似物。通过琼脂糖凝胶电泳验证mRNA的质量。

靶向5’UTR的锤头型核酶

mRNA序列设计中常用的天然5’UTR序列为人α珠蛋白（hAg）和TEV病毒来源，基于这两种常见的5’UTR序列，研究设计了5条靶向性核酶。

注：核酶（ribozyme) 是一类具有酶特性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子。文中基于常用的天然5’UTR序列设计了特异靶向性核酶，以扩大其适用范围。

                                       图3: 五种核酶的长度及切割位点

5’端短片段的切割与纯化

核酶与mRNA 5’ UTR特定区域退火结合，在镁离子存在下，发生核酶介导的酶切反应，产物包括10-30 nt的5’端短片段、3’端长片段、全长mRNA与核酶。其中5’端短片段带或不带帽结构，之间相差1个核苷酸。使用RNeasy Mini Kit RNA提取试剂盒，基于硅胶柱对核酶切割反应产物进行纯化，去除全长mRNA和3’端长片段，纯化得到的5’端短片段和核酶，用于后续的分析。

变性凝胶电泳分析加帽率

研究使用编码促红细胞生成素（EPO）的mRNA，使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），通过带或不带帽结构的条带比例定量检测加帽率。结果显示，所有未加帽的mRNA的5’端短片段在变性胶底部22 nt处显示高亮条带，酶法加帽的mRNA 5’端短片段在23 nt处显示较亮条带。而ARCA共转录加帽的样品在变性胶底部存在两条带，即存在带和不带帽结构的5’端短片段。随后利用软件进行定量分析，以计算加帽率。这项研究中酶法加帽率为84-100%，而ARCA加帽率是34-77%，提示ARCA共转录加帽率低于酶法加帽。

                              图4: 基于核酶的加帽率分析（尿素变性PAGE）

另外，研究发现，与核酶介导的酶切反应相比，RNase H酶切产物、包括纯化后的产物存在不同长度的长/短RNA条带，提示RNase H酶存在非特异性切割。

LC-MS分析加帽率。研究使用LC-MS对纯化后的5’端短片段进行定量分析，结果显示酶法加帽效率是89%，CleanCap共转录加帽的效率是99%，与尿素变性PAGE结果基本一致。

         图5: 基于核酶的加帽率分析（LC-MS）.左图为酶法加帽; 右图为共转录加帽.

三、结语

如文中所示，2016年诺华公司报道了一种无放射性标记的检测方法，使用生物素标记的RNase H切割探针，利用磁珠分离得到5’端寡核苷酸序列，随后通过LC-MS分析，有效分离加帽或不加帽的寡核苷酸序列，可定量分析mRNA样品的加帽率。

基于RNase H切割探针，结合HPLC或LC-MS分析，是当前工艺中常用的加帽率检测法，也是美国药典（USP）推荐的加帽率检测方法。但有报道显示，RNase H切割位点的专一性较差，可能影响结果的可靠性。为解决这一问题，BioNTech公司Vlatkovic I等开发出一种新的基于核酶的加帽率分析方法，筛选靶向5’UTR序列的切割核酶，经硅胶柱纯化后，进行变性PAGE或LC-MS，亦可有效分离带或不带帽结构的5’端寡核苷酸序列，实现mRNA加帽率的定量分析。且相比RNase H，核酶切割特异性较高，未产生非特异性条带，有望开发为研发或生产阶段mRNA的通用质控方法。

参考文献：

[1] Beverly M, Dell A, Parmar P, et al. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 2016 Jul;408(18):5021-30. doi: 10.1007/s00216-016-9605-x.

[2] Vlatkovic I, Ludwig J, Boros G, et al. Ribozyme Assays to Quantify the Capping Efficiency of In Vitro-Transcribed mRNA. Pharmaceutics. 2022 Jan 29;14(2):328. doi: 10.3390/pharmaceutics14020328.

[3] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）. 2020.

[4] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.