近期的一系列际遇都再次论证了我真的是一个靠运气闯荡江湖的人，鬼使神差的混入了一个超棒的实验室，并且受到了同伴和室友在工作和生活上的无私的照顾。日子像梦一样美好，我只想时间走的再慢一点，让我能把这里的四季再多看一眼，再看清楚一些。 记得之前果子老师说过，靠输出倒逼输入，我想尝试着把我的学习过程记录下来，理清思路，同时也许还能认识更多的再学习路上的小伙伴。（我真的考大学都没有这么努力过，倒着时差学习，哈哈）

就从这篇最经典的Drop-seq文章开始吧。 Russell 告诉我，这篇文章只需要看懂前两个图，我们来看看它们讲了什么。 图一（本文的图一，文章中的图二）

我来尝试以我的思路讲清楚它。 无论出于什么原因，你希望能够测到一个cell里面的转录组（transcriptome），根据illumina的测序仪，你是不可能在最后一步一个细胞一个细胞单独测的（我了解的不多，不知道这句话是否正确），所以一个正常的思路是，给每一个细胞一个单独的标记，并且，希望在标记的过程中每一个细胞都是分开的，并且不会互相接触到，这行在标记的过程中，才不会混。 那么，我们如何实现这个过程呢？ 首先，为了保证你的细胞在标记的过程中是分开的，这波人发明了一个叫做微流体设备的东西（microfuidic device） 里面有三个上样孔，在其中你可以分别加入1、你的样本细胞悬液，2、Gel Beads 3、partitioning oil。像下图中一样。

先来看看这些区段都是用来做什么的。 由内向外： Poly（dT）：用来和polyA结合，捕获mRNA UMI：用来标记不同的PCR产物（数count） 10xBarcode：用来标记不同的细胞 Sample Index：用来标记不同的样本 Truseq Read 1、2 ：用来进行连接beads，cDNA的PCR扩增和加P7接头 P5和P7：用来进行illumina的桥式PCR测序。 在这些序列中，P5、P7、Read 1、2 的序列是已知的 和beads上连接的序列最开始只有Read1 ，10x Barcode，和poly（dT），其他的这些接头是怎样一步步加上，并且发挥作用的？10xGenomics的说明书上给了具体步骤。我看下来，觉得最主要的思想，就是用已知的序列设计引物，PCR出未知的序列。

利用Poly（dT）来捕获mRNA，反转录出cDNA的第一条链，并且在cDNA的末端加上CCC序列，和TSO序列的GGG序列互补，并以TSO序列为模板，继续延申。这其实很重要，因为中间cDNA的序列我们是不知道的，如果不加上这个接头，就没有办法设计引物，合成cDNA的第二条链。

对TSO序列和Read1 设计引物，合成cDNA的第二条链，并完成cDNA的扩增。

因为II代测序illumina测序不能测很长，约为200-700bp，所以不能测得mRNA全长，所以会把合成的cDNA利用酶打断到illumina能测的长度，然后再两边加上接头，Read2。 设计部分与Read1和Read2重叠的引物，加上P5，P7和sample index，就可以去进行illumina测序了。

我画了一张图（homework，哈哈），加上了序列，用来弄清楚这个过程。 下一步是再看一遍说明书，对着这个过程，弄懂每个操作是在干什么。 小刀老师说：好好学习，天天向上啊！