靶向FLT3、PD

2023-03-15 16:51| 来源: 网络整理| 查看: 265

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年7月4日提交的美国临时申请62/693,977号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。

技术领域

本公开总体上涉及人类免疫学领域，特别是免疫疗法。

背景技术

急性髓细胞性白血病(AML)是常见的血液学癌症。据估计，2019年将预测有21,450例新病例，参见cancer.org/cancer/acute-myeloid-leukemia/about/key-statistics.htm，最后一次访问时间为2019年7月2日。尽管该疾病对诱导和巩固化疗有反应，但大多数患者不可避免地会复发。65岁以上的AML患者的治疗方案尤其不成功，超过75％的患者在5年内死于其疾病。因此，治疗还没有优化。因此，针对该疾病的新颖治疗方法应成为优先事项。本公开提供了这样的新颖方法、用于其中的组合物以及相关的优点。

概述

尽管一般而言AML是异质性的，但是许多AML类型共享共同的FLT3表达，这种表达存在于大约80％的患者中，并且在大约20％的AML患者中具有高表面密度表达。另外，高达80％的AML患者胚细胞可以表达PD-1的配体(称为PD-L1)，而PD-1表面表达可以在大多数AML患者的T细胞上发现。

嵌合抗原受体(CAR)疗法是针对淋巴恶性肿瘤的最成功的细胞免疫疗法之一。CAR是一种基因工程免疫表面受体，包含针对肿瘤抗原的抗体的Fab部分，该部分与活化分子的胞内域(例如CD28和CD3ζ)相连。在针对AML相关抗原的T细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达的CAR的临床前模型显示出有希望的治疗效果。由于NK细胞而非T细胞不会引起移植物抗宿主病(GVHD)，因此CAR NK细胞可以成为CAR T细胞的重要替代物。在抗CD19 CAR T细胞的最新研究中，30％的B-ALL患者对CAR T治疗无反应，这是因为交替剪接的CD19亚型和受损的抗CD19 CAR表位。T细胞缺乏“自然杀伤力”，即它们需要CAR触发来杀死肿瘤细胞。NK细胞具有自发的细胞毒性，因此即使在没有触发CAR的情况下也可以杀死某些肿瘤靶标，例如AML。因此，NK细胞的内在溶细胞机制可以提供对抗癌症从CAR治疗中逃逸的二级防御。了解CAR在其他免疫细胞(例如NK细胞)中的功能方式将产生影响，并将有助于设计下一代CAR T细胞和CAR NK细胞疗法的替代方法或补充方法。

在许多临床试验中，正在积极研究诸如抗PD-1Pembrolizumab(Keytruda)和抗PD-L1 Atezolizunab(Tecentriq)等检查点抑制剂。但是，某些毒性阻碍了其进一步发展。例如，由于普遍的毒性，最近停止了Pembrolizumab的III期临床试验。这可能与大规模T细胞活化和全身性自身免疫作用有关。抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的局部递送可能是优选的。同样，用针对CD123或CD33的CAR治疗AML尚未显示出任何临床成功。不受理论的束缚，申请人假设靶向AML胚细胞上表达的FLT3的CAR将对的FLT3(+)AML患者具有治疗益处，具有更好的安全性。

此外，系统地给予FDA批准的抗PD-1和抗PD-L1单克隆抗体(mAb)，并与表达PD-1(+)或PD-L1的所有细胞结合。这些mAb的全身静脉内输注涉及大剂量输注，并伴有轻度、中度和严重的不良反应，包括疲劳、发热(发烧)、发冷和“输液反应”，每个都需要医疗护理。输液反应很少见，但可能导致血压严重下降，需要与药物一起进行液体复苏。与这些mAb的给药有关的其他证据充分的毒性(从轻度到严重)包括皮肤病学、胃肠道、内分泌、肝脏和肺部毒性。参见，例如Naidoo et al.(2015)Annals of Oncology,Volume 26,Issue 12,Pages2375–2391。通过对CAR T或NK细胞进行改造以一旦将CAR T或NK细胞注入体内就分泌抗PD-1或抗PD-L1 mAb，本发明的CAR T或NK细胞消除了对抗PD-1或抗PD-L1 mAb多次静脉输注的需要。因此，本公开的CAR T或NK细胞通过单独的重复施用消除了将大药理学剂量的抗PD-1和/或抗PD-L1 mAb注入到血流中的需要。基于迄今为止公开的药理学和毒性数据，可以合理地假设本发明将会避免所有PD-1(+)T或NK细胞立即被抗PD-1mAb饱和，很可能会减少部分或全部上面提到的不良事件。另外，(1)抗体的释放只会随着CAR T或NK细胞的扩增而发生，因此抗PD-1或抗PD-L1 mAb会逐渐释放到血液中；(2)鉴于CAR将CAR T或NK细胞归巢于肿瘤，与目前已获得FDA批准的多次大规模静脉内全身给药相比，抗PD-1或抗PD-L1 mAb的释放将更局限在肿瘤微环境中，因此将其抗肿瘤作用更多地定位于肿瘤微环境中的相关T或NK细胞。此外，由于不需要抗PD-1或抗PD-L1 mAb输注，因此该方法可为患者节省大量成本(大约节省六位数)。

出乎意料的是，最近报道了来自癌症患者的人类自然杀伤细胞表达PD-L1，并且意外地发现与NK细胞结合的抗PD-L1抗体增加了对肿瘤细胞的NK细胞杀伤。因此，本公开通过感染的NK细胞同时表达CAR和分泌的抗PD-L1，可以显著增强在肿瘤微环境中局部杀伤肿瘤细胞的NK。

为此，本文公开了一个或多个载体或分离的多核苷酸，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)以及细胞内结构域；以及编码包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，连续的多核苷酸或单个载体进一步同时包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)以及细胞内结构域；以及编码包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体的核酸序列的多核苷酸。在其他实施方案中，本文提供了分离的核酸或载体，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：

a.编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)以及细胞内结构域；以及

b.编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，所述抗体或其抗原结合片段包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。

在进一步的实施方案中，载体可以是多顺反子的，任选地是双顺反子的(bicistronic)，和/或每个多核苷酸可以可操作地连接至调节性多核苷酸序列，例如增强子元件和/或启动子元件。

本发明的连续多核苷酸的实例在图1中示出。在一些实施方案中，本公开内容提供了以下中的每一个：(1)编码如上所公开及在其内的CAR的核酸序列的多核苷酸以及在一方面，所述CAR包含：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)以及细胞内结构域；以及(2)编码包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，(1)和(2)的多核苷酸包含在分开的独立多核苷酸上或在分开的载体内。

在任何上述实施方案中，载体是质粒或病毒载体，其任选地选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

在任何上述实施方案中，多核苷酸和/或载体可以任选地包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：可检测的标记和/或赋予抗生素抗性的多核苷酸和/或用于CAR和识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合域的转录和翻译的调节元件。在另一方面，所述治疗方法与鉴别适合于治疗的对象或患者的诊断方法相结合，所述诊断方法分析从对象的患者分离的合适样品的FLT3和/或PD-1和/或PD-L1的表达，并确定表达FLT3、PD-1和/或PD-L1中的一种、两种或三种的患者或对象适合治疗。在另一方面，然后将所述疗法施用于对象或患者。合适的样品包括那些包含癌细胞和/或肿瘤细胞的样品。

上文公开的编码CAR的分离的核酸或载体可以包含本文公开的任何CAR，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，编码CAR的本发明的分离的核酸或载体进一步包含信号传导结构域，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，编码CAR的分离的核酸或载体进一步包含可诱导的或组成型活性元件。在一个实施方案中，可诱导的或组成型活性元件控制编码免疫调节分子或细胞因子的多核苷酸的表达。免疫调节分子或细胞因子可以包含以下中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、LEC和/或OX40L。在另一方面，免疫调节分子或细胞因子可以包含以下因子，或基本上由其组成，或由其组成：IL-12和/或GM-CSF；和/或IL-12和/或IL-2和低毒性IL-2中的一种或多种；和/或IL-12和/或IL-15；和/或IL-12和/或IL-21；IL-12和/或B7.1；和/或IL-12和/或OX40L；和/或IL-12和/或CD40L；和/或IL-12和/或GITRL；和/或IL-12和/或IL-18；和/或IL-2和低毒性IL-2中的一种或多种以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或IL-15和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或IL-21以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或GM-CSF以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或OX40L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或CD137L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或包含B7.1和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或CD40L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或GITRL以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种。

在以上任何实施方案中，每个多核苷酸可以可操作地连接至调节多核苷酸，其任选地是启动子和/或增强子。在一些实施方案中，编码包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可操作地连接至启动子和/或增强子，从而允许抗体或其抗原结合片段的低、中或高表达，或进一步的过表达。

在以上任何实施方案中，编码CAR的多核苷酸可以包含编码以下的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)CD8α铰链结构域；(c)CD8α跨膜结构域；(d)CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域。FLT3抗体的非限制性实例包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：重链可变区，其包含：CDHR1，其具有氨基酸序列(SYWMH)或(NYGLH)或其每一个的等效物，CDHR2，其具有氨基酸序列(EIDPSDSYKDYNQKFKD)或(VIWSGGSTDYNAAFIS)或其每一个的等效物，以及CDHR3，其具有氨基酸序列(AITTTPFDF)或(GGIYYANHYYAMDY)或其每一个的等效物；和/或轻链可变区，其包含：CDLR1，其具有氨基酸序列(RASQSISNNLH)或(KSSQSLLNSGNQKNYM)或其每一个的等效物，CDLR2，其具有氨基酸序列(YASQSIS)或(GASTRES)或其每一个的等效物，以及CDLR3，其具有氨基酸序列(QQSNTWPYT)或(QNDHSYPLT)或其每一个的等效物。

包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段的非限制性实例包括PD-1拮抗剂或激动剂和/或PD-L1拮抗剂或激动剂。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR区或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1和/或PD-1的抗体的重链可变区和轻链可变区和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)，和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，包含识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段包含含有PD-L1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是双特异性抗体。双特异性抗体的非限制性实例包括针对PD-1的抗体和针对PD-L1的抗体的相关CDR区，或其每一个的等效物，以及任选的接头。另外的非限制性实例包括针对PD-1的抗体和针对PD-L1的抗体的相关CDR区，或其每一个的等效物，以及任选的接头。另一个实例包括针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或其每一个的等效物，以及任选的接头。又一个实例包括：单链可变片段(scFv)，其包含PD-1抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成；以及单链可变片段(scFv)，其包含PD-L1抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成，和/或其每一个的等效物；以及任选的接头。

本文还提供了一种分离的细胞，其包括以下组分，或基本上由其组成，或由其组成：以上实施方案中任一项的抗体、载体和/或分离的多核苷酸中的任何一种或多种，单独或彼此组合。该细胞可以是原核或真核细胞，并且任选地选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人细胞。在一些实施方案中，真核细胞是免疫细胞，任选地是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、或巨噬细胞。在其他实施方案中，免疫细胞是T细胞，其可以使用任何合适的系统(例如CRISPR系统)任选地被修饰以抑制内源TCR表达。在与分离的细胞有关的上述任何实施方案中，分离的细胞在细胞表面表达CAR，并分泌包含识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合域的抗体或其抗原结合片段，该抗体任选地是双特异性抗体。

更进一步的方面涉及一种组合物，其包含本文公开的载体和/或分离的核酸和/或分离的细胞中的任何一种或多种，以及任选的载体，其任选地是药学上可接受的载体。本文还提供了一种组合物，其包含以下成分，或基本上由其组成，或由其组成：本文公开的分离的核酸或载体、抗体、抗原结合片段、多肽、分离的细胞和/或细胞群，以及任选的药学上可接受的载体。在进一步的实施方案中，该组合物包含有效量的FLT3抑制剂，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，所述有效量是有效增加癌细胞或肿瘤细胞上的FLT3表面表达的量。

本发明还提供了分离的复合物，其包含与以下物质结合的表达CAR的任何分离的细胞：(i)表达FLT3和/或PD-1和/或PD-L1和/或其片段的细胞，和/或(ii)FLT3和/或PD-1和/或PD-L1和/或其片段。

还公开了产生CAR表达细胞的方法。该方法包括用本文公开的多核苷酸或载体转导分离的细胞。在一些实施方案中，分离的细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、或巨噬细胞。在一些实施方案中，分离的细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、或巨噬细胞。在进一步的实施方案中，分离的细胞是T细胞，其任选地被修饰以抑制内源TCR表达。在其他实施方案中，分离的细胞是NK细胞。可以从任何合适的物种(例如哺乳动物如人类细胞)中分离细胞。

表达CAR的细胞可用于诊断和治疗。在一方面，所述细胞可用于抑制各自表达FLT3的癌细胞或肿瘤的生长的方法，任选地其中所述细胞是FLT3急性髓细胞性白血病(AML)细胞。本发明还涉及在对象中抑制表达FLT3的癌症或肿瘤(任选地急性髓细胞性白血病(AML))的生长的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：使癌症或肿瘤与本公开内容的分离的细胞或组合物接触。在一方面，抑制对象中表达FLT3的癌症或肿瘤(任选地AML)的生长的方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：测量对象中PD-1和/或PD-L1的表达，并将本发明的分离的细胞、抗体、抗原结合片段和/或组合物施用至表达PD-1和/或PD-L1的对象。本文进一步公开了抑制对象中癌症或肿瘤(任选地AML)的生长的方法，其包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：测量对象中PD-1和/或PD-L1的表达，以及向表达PD-1和/或PD-L1的对象施用抗体、抗原结合片段和/或组合物。该方法可以包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：使癌细胞或肿瘤与本文以上公开的任何分离的细胞或组合物接触。接触可以是体外或体内的。在一些实施方案中，接触是体内的，并且分离的细胞对于所治疗的对象是自体同源的和/或同种异体的。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：向对象施用有效量的细胞还原疗法，该细胞还原疗法任选地包括或选自化学疗法、冷冻疗法、热疗、靶向疗法和/或放射疗法。在一些实施方案中，被治疗的对象是人类患者。

本文进一步提供的抗体包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，该单链可变片段序列包括以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：(Q VQ L V Q S G V E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T N Y Y M Y W V R Q A PG Q G L E W M G G I N P S N G G T N F N E K F K N R V T L T T D S S T T T A YM E L K S L Q F D D T A V Y Y C A R R D Y R F D M G F D Y W G Q G T T V T V SS G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T CR A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S F L Y S G V P S R FS G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L Y H P A T F G Q GT K V E I K R)或其等效物。在一方面，包含单链可变片段序列(scFv)或基本上由其组成或由其组成的抗体由包含以下核酸序列或基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列编码：(CAGGTCCAATTGGTACAGAGCGGCGTCGAAGTAAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTTAAAGTTTCTTGCAAGGCTTCAGGATATACTTTCACTAACTACTATATGTACTGGGTACGGCAGGCTCCAGGGCAAGGGTTGGAGTGGATGGGAGGGATCAATCCTTCTAACGGCGGCACTAACTTTAACGAAAAATTTAAAAATAGGGTGACCCTCACAACTGACTCAAGTACGACTACAGCATACATGGAACTCAAATCTCTCCAATTCGATGACACGGCTGTCTATTATTGCGCGAGAAGAGACTATCGCTTCGATATGGGGTTTGATTATTGGGGGCAAGGTACTACGGTTACCGTCAGCTCCGGGGGTGGCGGCTCCGGCGGCGGTGGGTCAGGTGGAGGAGGGTCTGACATTCAGATGACGCAATCCCCAAGCTCTCTGTCCGCGTCAGTGGGCGACCGAGTTACAATCACATGCCGCGCTTCTCAAGATGTGTCAACCGCTGTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCTGGGAAGGCCCCTAAGCTTCTCATCTACTCAGCTTCTTTTCTGTACTCAGGGGTACCGTCTAGATTCTCAGGATCCGGTAGTGGGACGGACTTCACATTGACCATAAGTTCCTTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATATTATTGCCAACAGTACCTTTACCATCCTGCCACTTTTGGCCAGGGTACTAAGGTCGAGATCAAACGG)或其等效物。

本文进一步提供的抗体包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，该单链可变片段序列包括以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGEAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK)或其等效物。

在一方面，抗体包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，该单链可变片段序列由核苷酸序列编码，该核苷酸序列包括以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

(GAAGTTCAGTTGGTCGAGTCAGGAGGAGGCCTGGTGCAACCCGGGGGCTCACTCCGGTTGTCCTGTGCTGCTTCAGGATTTACGTTTTCTGACTCATGGATACATTGGGTGCGCCAAGCCCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGGTGGCCTGGATCTCTCCGTATGGGGGTTCCACCTACTATGCTGATTCAGTAAAAGGACGGTTCACTATAAGCGCGGATACAAGTAAGAATACTGCCTATCTTCAAATGAATTCTCTTCGCGCCGAGGATACAGCGGTATATTATTGCGCTAGACGACATTGGCCAGGGGGCTTTGACTATTGGGGGCAGGGTACTCTTGTGACCGTTAGTGCGGGAGGTGGTGGCAGCGGTGGAGGCGGCTCCGGGGGTGGTGGTTCAGAAATTGTCCTGACTCAATCCCCTGCCACATTGAGTTTGAGCCCAGGAGAGAGAGCAACTCTGTCATGCCGGGCGTCAAAAGGTGTCAGTACGTCAGGCTACTCCTATCTTCATTGGTATCAGCAGAAACCGGGAGAAGCGCCGCGCCTTCTCATATACCTGGCTAGTTACCTTGAGAGTGGCGTCCCGGCCCGGTTTAGTGGGAGTGGGTCTGGGACTGATTTTACGCTGACAATCAGCAGTCTTGAGCCAGAGGACTTCGCGGTTTACTATTGCCAACATTCACGCGATTTGCCCCTCACCTTCGGCGGTGGAACGAAGGTTGAAATAAAA)或其等效物。

本文还描述了双特异性抗体，其包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，所述单链可变片段序列包含以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

(Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T N Y Y MY W V R Q A P G Q G L E W M G G I N P S N G G T N F N E K F K N R V T L T T DS S T T T A Y M E L K S L Q F D D T A V Y Y C A R R D Y R F D M G F D Y W G QG T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S V GD R V T I T C R A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S F L YS G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L Y HP A T F G Q G T K V E I K R)和/或

在一方面，双特异性抗体包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，所述单链可变片段序列由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

(CAGGTCCAATTGGTACAGAGCGGCGTCGAAGTAAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTTAAAGTTTCTTGCAAGGCTTCAGGATATACTTTCACTAACTACTATATGTACTGGGTACGGCAGGCTCCAGGGCAAGGGTTGGAGTGGATGGGAGGGATCAATCCTTCTAACGGCGGCACTAACTTTAACGAAAAATTTAAAAATAGGGTGACCCTCACAACTGACTCAAGTACGACTACAGCATACATGGAACTCAAATCTCTCCAATTCGATGACACGGCTGTCTATTATTGCGCGAGAAGAGACTATCGCTTCGATATGGGGTTTGATTATTGGGGGCAAGGTACTACGGTTACCGTCAGCTCCGGGGGTGGCGGCTCCGGCGGCGGTGGGTCAGGTGGAGGAGGGTCTGACATTCAGATGACGCAATCCCCAAGCTCTCTGTCCGCGTCAGTGGGCGACCGAGTTACAATCACATGCCGCGCTTCTCAAGATGTGTCAACCGCTGTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCTGGGAAGGCCCCTAAGCTTCTCATCTACTCAGCTTCTTTTCTGTACTCAGGGGTACCGTCTAGATTCTCAGGATCCGGTAGTGGGACGGACTTCACATTGACCATAAGTTCCTTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATATTATTGCCAACAGTACCTTTACCATCCTGCCACTTTTGGCCAGGGTACTAAGGTCGAGATCAAACGG)和/或

所述抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在一个特定的方面，所述抗体包含恒定区，或基本上由其组成，或由其组成。所述恒定区可以包含IgA、IgD、IgE、IgG或IgM恒定区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，所述恒定区是IgG1恒定区或Igκ恒定区。

本公开还涉及抗体，其与本文所述的抗体竞争结合。本公开的抗体可以是多克隆、单克隆或人源化抗体。本文还提供了本公开的抗体的抗原结合片段。所述抗原结合片段可以选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。在一个方面，抗原结合片段可以包含以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：(Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S V K V S C KA S G Y T F T N Y Y M Y W V R Q A P G Q G L E W M G G I N P S N G G T N F N EK F K N R V T L T T D S S T T T A Y M E L K S L Q F D D T A V Y Y C A R R D YR F D M G F D Y W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M TQ S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G K A PK L L I Y S A S F L Y S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D FA T Y Y C Q Q Y L Y H P A T F G Q G T K V E I K R)或其每一个的等效物。抗原结合片段可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

在另一个方面，抗原结合片段可以包含以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGEAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK)或其每一个的等效物。抗原结合片段可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

本文还描述了多肽，其包含以下任一项的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：(Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T N Y Y M Y WV R Q A P G Q G L E W M G G I N P S N G G T N F N E K F K N R V T L T T D S ST T T A Y M E L K S L Q F D D T A V Y Y C A R R D Y R F D M G F D Y W G Q G TT V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D RV T I T C R A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S F L Y S GV P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L Y H P AT F G Q G T K V E I K R)或

本发明进一步涉及分离的核酸，其包含以下中的任一个核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

本文进一步公开了制备本公开的抗体的方法。

本文还提供了本公开的抗体的抗原结合片段。本文进一步描述了多肽，其包含以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

本公开进一步涉及分离的核酸，其包含以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

本文还公开了试剂盒，其包含上述组合物中的一种或多种及其在本文公开的方法中的使用说明，或基本上由其组成，或由其组成。

附图说明

图1显示了具有分泌性PD-1-PD-L1双特异性抗体(biAb)的双顺反子FLT3 CAR的设计。FLT3 CAR由EF1α启动子驱动。PD-1-PD-L1 biAb通过T2A与CAR连接，并由分泌信号肽(SS)引导。整个表达盒在安全的慢病毒构建体中两侧带有长末端重复序列。

图2A-2C显示了在识别FLT3(+)AML细胞系后增强的细胞毒性。未修饰的NK-92细胞、EV NK-92细胞和FLT3 CAR NK-92细胞对以下细胞的细胞毒活性：(图2A)FLT3(+)MOLM-13(FLT3(+)EOL-1或(FLT3(-)U937细胞；(图2B)使用

图3A-3C显示了FLT3 CAR T和FLT3 NK细胞抑制人AML的体内生长并延长了携带AML的小鼠的存活。对NSG小鼠注射FLT3(+)MOLM-13细胞(图3A)或FLT3(+)AML患者胚细胞(图3B)。一周后，静脉注射T细胞、带有空载体的T细胞或FLT3 CAR T细胞。(图3C)对于FLT3(+)CAR NK细胞，向NSG小鼠注射FLT3(+)MOLM-13细胞和NK、带有空载体的NK或FLT3 CAR NK(此处显示为“FLT3 CAR”)或注入PBS。绘制Kaplan-Meier。Δ＝连续CR。

图4A-4D显示了FLT-3CAR NK细胞和扩增的原代NK细胞表达高水平PD-1。(图4A)在转导后培养CAR NK细胞，并对抗PD-1抗体染色。(图4B)与IL-2、IL-15和IL-21一起培养的原代NK细胞(无CAR转导)表达PD1。PD1表达对于CAR转导不是必需的。(图4C和4D)AML细胞系K562和Molm-13表达抗PD-1-抗PD-L1 biAb。数据来自一次代表性的运行。

图5A-5B显示了用FLT3 CAR-抗PD-1-抗PD-L1 biAb载体转导的T细胞的抗PD-1-抗PD-L1 biAb蛋白的分泌水平。转导后2天和3天，通过ELISA使用6x-his标签抗体测定切片水平。(图5A)ELISA的标准曲线。显示了两次的数据。(图5B)通过ELISA使用所示的6x-his标签检测了FLT3 CAR-抗-PD-1-抗-PD-L1 biAb转导的T细胞中抗-PD-1-抗-PD-L1 biAb的分泌水平。显示了两次的重复数据(红色和蓝色)。基于图5A所示的标准曲线，从OD 450nm的值收集数据。

图6A-6B显示了转导后5天使用6x-his标签抗体通过ELISA测定的通过FLT3 CAR-抗PD-1、FLT3 CAR-抗PD-1L1或FLT3 CAR-PD-1-PD-L1 biAb载体转导的T细胞的分泌水平。(图6A)ELISA的标准曲线。显示了两次的数据。(图6B)分别通过FLT3 CAR-抗PD-1、FLT3CAR-抗-PD-L1或FLT3 CAR-抗PD-1-抗PD-L1 biAb载体转导的T细胞的抗PD-1、抗PD-L1或PD-1-PD-L1 biAb的分泌水平。使用所示的6x-his标签抗体通过ELISA确定分泌水平。显示了来自三个不同供体(24、25、26、27)的数据。

图7显示了表达抗PD-L1、抗PD-1、抗PD-1-抗PD-L1 biAb的FLT3 CAR T细胞，或用针对CAR的抗Fab对细胞进行染色后通过流式细胞仪检测的感染和纯化。显示了一个代表性供体的数据。

图8A-8B报告了四小时的基于流的杀伤测定的结果，其显示纯化的FLT3 CAR-抗PD-1T细胞与纯化的FLT3 CAR T细胞一样维持细胞毒性水平。(图8A)以2种FLT3(+)AML肿瘤细胞系和1种(FLT3(-)AML肿瘤细胞系为靶细胞。所有肿瘤细胞均用AM荧光染料预处理。将细胞门控在AML靶细胞上，并且对于Sytox Blue(Y轴)呈阳性的细胞代表了被杀死的肿瘤细胞的能力。(图8B)E：T(效应子：靶)比率为3的图8A的摘要数据。

图9显示从FLT3抗PD-1CAR-T细胞分泌的抗PD-1抗体增加了FLT3 CAR T细胞的生存力。灰色柱显示未经处理的健康捐献者的始发态(primed)T细胞。黑柱显示了FLT3 CAR T细胞(作为阴性对照)。浅绿色柱显示了用含有分泌的抗PD-1Ab(15ng/ml)的上清液培养的FLT3 CAR T细胞。带有阴影线的浅绿色柱显示了用上清液预处理的FLT3 CAR T细胞，该上清液含有与10μg/ml PD-1融合蛋白一起孵育30分钟的15ng/ml分泌的抗PD-1Ab。深绿色的柱显示了用抗PD-1Ab(BD Biosciences，作为阳性对照)培养的FLT3 CAR T细胞。蓝色柱显示了用含有分泌的抗PD-1Ab(15ng/ml)的上清液培养的FLT3-抗-PD-1CAR T细胞。带有阴影线的蓝色柱显示了用上清液培养的FLT3-抗-PD-1CAR T细胞，该上清液含有与10μg/ml PD-1融合蛋白一起孵育30分钟的分泌的15ng/ml抗PD-1ab。通过MTT测定评估细胞增殖。

图10显示了用媒介物对照或以下FLT3抑制剂处理48小时的MOLM-13、U937、THP-1、MV4-11和EOL-1AML细胞系中表面FLT3表达的定量：10μM米哚妥林(midostaurin)，10μM FF-10101，10μM奎扎替尼(quizaritinib)(AC220)，或10μM多韦替尼(Dovitinib)(TKI-258)。数据显示，在大多数情况下，用FLT3抑制剂处理后，FLT3表面密度表达增加。

图11描绘了在用米哚妥林处理48小时之前和之后，通过流式细胞术对AML胚细胞上的FLT3表面密度表达的定量。该图显示在处理后，AML胚细胞上的FLT3表面密度表达被上调。

图12描绘了所提出的FLT3抗PD-1-抗PD-L1 CAR NK和FLT3抗PD-1-抗PD-L1CAR T细胞与FLT3(+)AML胚细胞相互作用并分泌阻断PD-1(+)T细胞和/或NK细胞与PD-L1(+)白血病胚细胞之间的PD1-PD-L1相互作用的抗PD-1-抗-PD-L1biAb的机制。

详细说明

应该理解的是，本公开不被限制至所描述的特定方面，因为这些方面当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的方面，并且并非旨在限制，因为本公开的范围将仅仅被附加的权利要求限制。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有与属于本技术的技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本技术的实践或测试，但现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文所引用的所有技术和专利出版物其全文均通过引用方式并入本文。本文的任何内容均不应被解释为承认由于在先公开而本公开不早于这样的公开。

除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术范围内。参见例如，Green andSambrook eds.(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4

所有数字指定(包括范围)，例如pH、温度、时间、浓度、以及分子量，都是近似值，其在适当时以1.0或0.1、或+/-15％、或10％、或5％、或2％的增量((+)或(-))变化。应该理解的是，尽管并非总是明确地说明，但是所有的数字值前面都有术语“约”。还应该理解的是，尽管并非总是明确地说明，但是本文所述的试剂仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。

在没有明确描述的情况下应该推断并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。

定义

除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文使用的，术语“包含”旨在意为组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该意为排除对于预期目的的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法中排除微量污染物和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)。“由……组成”应当意为排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本公开的范围之内。

如本文使用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。

术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在此被可交换地使用，是指人类和兽医学对象，例如人类、动物、非人类灵长类动物、狗、猫、绵羊、老鼠、马和牛。在一些实施方案中，对象是人。

如本文使用的，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物(例如人类、山羊、兔和鼠)以及非哺乳动物物种(例如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有具体说明，否则术语“抗体”包括特异性地结合至感兴趣的分子(或感兴趣的高度相似的分子的群组)以至于实质性排除结合至其他分子的完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”(例如，在生物样品中与对其他分子的结合常数相比，对感兴趣的分子的结合常数大至少10

如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指通过B淋巴细胞的单一克隆产生的抗体，或者通过其中已经转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法制造的，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合而制造杂交的抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。

就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链和轻链都包括恒定区和可变区(所述区也被称为“结构域”)。重链和轻链可变区一起特异性地结合抗原。重链和轻链可变区包括被三个高度可变区间隔开的“框架”区，所述高度可变区也被称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR的范围已经被确定(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Department of Health and Human Services,1991，其以引用的方式合并入本文中)。Kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区，即组成的轻链和重链的结合的框架区，主要采用β折叠构象，而CDR形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区作用来形成支架，其用来通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向中。

CDR主要负责结合至抗原的表位。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次进行编号，并且通常也由该特定的CDR所位于的链而确定(重链区域标记为CDHR，轻链区域标记为CDLR)。因此，CDHR3是来自发现它的抗体的重链可变域的CDR3，而CDLR1是来自发现它的抗体的轻链可变域的CDR1。FLT3抗体将具有FLT3抗原特有的特异性V

如本文所用，术语“PD-1”与此名称相关的特定蛋白质片段以及与如本文所示的PD-1序列和/或PD-L1的合适的结合伴侣具有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、优选90％的序列同一性、或者至少95％的序列同一性的具有类似生物学功能的任何其他分子。本文提供了PD-1的非限制性实例序列，例如但不限于以下参考编号的序列：GCID:GC02M241849；HGNC:8760；Entrez Gene:5133；Ensembl:ENSG00000188389；OMIM:600244；和UniProtKB:Q15116；以及序列：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL，及其等效物。

商购可得的抗体的非限制性实例包括派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、尼武单抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、pidilizumab(Cure Tech)、AMP-224(GSK)、AMP-514(GSK)、PDR001(Novartis)、以及cemiplimab(Regeneron and Sanofi)。

如本文所用，术语“PD-L1”与此名称相关的特定蛋白质片段以及与如本文所示的PD-L1序列和/或PD-1的合适的结合伴侣具有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、优选90％的序列同一性、或者至少95％的序列同一性的具有类似生物学功能的任何其他分子。本文提供了PD-L1的非限制性实例序列，例如但不限于以下参考编号的序列：GCID:GC09P005450；HGNC:17635；Entrez Gene:29126；Ensembl:ENSG00000120217；OMIM:605402；以及UniProtKB:Q9NZQ7；以及序列：MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET，及其等效物。商购可得的抗体的非限制性实例包括atezolizumab(Roche Genentech)、avelumab(Merck Soreno and Pfizer)、durvalumab(AstraZeneca)、BMS-936559(Bristol-Myers Suibb)、以及CK-301(Chekpoint Therapeutics)。

如本文所用，术语“抗原”是指可以被特定体液或细胞免疫产物(例如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢产物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子，例如复杂的碳水化合物(例如多糖)、磷脂和蛋白质。抗原的常见类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫疾病、变态反应和移植排斥、毒素的抗原和其他杂种抗原。

如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指可以特异性结合抗原靶标的任何蛋白质或多肽结构域。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指可以结合两种不同类型的抗原(例如具有两个不同的抗原结合结构域)的抗体。

如本文所用，术语“信号肽”是指导蛋白质在细胞内的运输和定位的肽序列，例如，到达特定的细胞器(例如内质网)和/或细胞表面。本文公开了信号肽的非限制性实例，例如，由以下核酸序列编码的肽：

信号肽序列：

ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC，以及任选的其等效物。

信号肽序列：

MGWSCIILFLVATATGVHS，以及任选的其等效物。

信号肽序列：

MDWIWRILFLVGAATGAHS，以及任选的其等效物。

如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体与抗原之间的接触具有至少10

在一方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”意为抗体如通过ELISA或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。

在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本公开涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本公开的范围内。如本文使用的，在提及参照蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70％同源性或同一性、或至少80％同源性或同一性和替代地、或至少约85％、或替代地至少约90％、或替代地至少约95％、或替代地98％百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当提及多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。

如本文使用的，术语“自体同源的”在涉及细胞时是指，被分离并且被输回相同的对象(受体或宿主)的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。

如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一方面，术语“分离的”是指，核酸(例如DNA或RNA)或蛋白或多肽(例如抗体或其衍生物)或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基(当通过重组DNA技术产生时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。

如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。

“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)以及骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。

如本文使用的，术语“NK细胞”(也被称为自然杀伤细胞)是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的NK细胞系的非限制性实施例包括NK-92(

如本文使用的，术语“B细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后发展成记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞(例如T细胞)的不同点在于细胞表面上存在B细胞受体。B细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的B细胞系的非限制性实施例包括AHH-1(

如本文使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如B细胞)的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。T细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性实施例包括BCL2(AAA)Jurkat(

如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且在其最广泛的意义上是指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一方面，所述子单元可以通过其他键(例如酯键、醚键等)而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。

如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常编码该多肽的DNA被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。

多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基(或氨基酸)在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝不重复的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。

术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，则可在多核苷酸的组装之前或之后对核苷酸结构施加修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分结合。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。

如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白的量确定基因的表达水平。在一方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。

如本文使用的，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中产生的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。

如本文使用的，术语“CRISPR”是指依赖于规律成簇的间隔短回文重复序列通路的序列特异性基因操作的技术。CRISPR可用于执行基因编辑和/或基因调控，以及用于简单地将蛋白质靶向至特定的基因组位置。“基因编辑”是指一种基因工程的类型，其中通过向多核苷酸序列引入缺失、插入、单链或双链断裂或碱基取代来改变该靶多核苷酸的核苷酸序列。在一些方面，CRISPR介导的基因编辑利用非同源末端连接(NHEJ)或同源重组的途径来执行该编辑。基因调控是指增加或减少特定基因产物(例如蛋白质或RNA)的产生。

如本文使用的，术语“gRNA”或“指导RNA”是指为了利用CRISPR技术进行基因编辑，用于靶向特定多核苷酸序列的指导RNA序列。设计用于靶标特异性的gRNA和供体治疗性多核苷酸的技术是本领域众所周知的。例如，Doench,J.,et al.Nature biotechnology2014、32(12):1262-7,Mohr,S.et al.(2016)FEBS Journal 283:3232-38和Graham,D.,etal.Genome Biol.2015；16:260。gRNA包含融合多核苷酸或多核苷酸，或基本上由其组成，或进一步由其组成，所述融合多核苷酸包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)；所述多核苷酸包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRIPSPR RNA(tracrRNA)。在一些方面，gRNA是合成的(Kelley,M.et al.(2016)J of Biotechnology 233(2016)74-83)。如本文所用，gRNA的生物学等效物包括但不限于可以将Cas9或其等效物引导至特定核苷酸序列(例如细胞基因组的特定区域)的多核苷酸或靶向分子。

如本文使用的，术语“共有序列(consensus sequence)”是指这样的氨基酸或核苷酸序列，其通过对齐一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在所述多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该系列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。

术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的互补序列，并且编码序列可以由此导出。

如本文涉及调节性多核苷酸时使用的，术语“可操作地连接”是指调节性多核苷酸和与其连接的多核苷酸序列之间的结合，当特定蛋白质结合至调节性多核苷酸时，转录所连接的多核苷酸。

调节序列或元件包括启动子、增强子和/或启动子/增强子组合。调节编码核酸的表达的启动子可以是组成型启动子。组成型启动子的非限制性实例包括SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC和CAGG。在一方面，增强子是土拨鼠后调节元件(“WPRE”)(参见，例如Zufferey,R.et al.(1999)J.Virol.73(4):2886-2992)。增强子元件可以在启动子的下游。

如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是多核苷酸序列的一个区域并在此控制转录的起始和速率的控制序列。它可以包含遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。

如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能(例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，即全长序列的活性)，则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。

如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域(例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60％同一性、优选地至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被比对的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定比对和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel et al.,eds.1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGHSCORE；数据库＝不重复的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的互补序列。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40％的同一性、或者替代地少于25％的同一性。

“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如PCR过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。

严格杂交条件的实施例包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中度杂交条件的实施例包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格杂交条件的实施例包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC至约0.1x SSC的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。

如本文所用，术语“免疫调节分子”可以指可以调节或直接影响免疫应答的任何分子，包括但不限于：趋化因子，例如CCL2、CCL5、CCL14、CCL19、CCL20、CXCL8、CXCL13和LEC；淋巴因子和细胞因子，例如白介素(例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等)、干扰素α、β和γ、刺激细胞生长的因子(例如GM-CSF)和其他因素(例如肿瘤坏死因子、DC-SIGN、MlPlα、MlPlβ、TGF-β或TNF)；为T细胞活化提供共刺激信号的因子，例如B7分子和CD40；辅助分子，例如CD83；涉及抗原加工和呈递的蛋白质，例如TAP1/TAP2转运蛋白，蛋白质体分子，例如LMP2和LMP7，热激蛋白，例如gp96、HSP70和HSP90，以及MHC或HLA分子；及其生物等效物。本文公开了免疫调节分子的非限制性实例。

如本文使用的，术语“B7.1”(也被称为B7、BB1、B7-1、CD80、LAB7、CD28LG、CD28LG1)是指与该名称相关的特定分子，以及与B7.1具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了B7.1序列的实例。另外，与GenBank登录号NM_005191.3和NP_005182.1相关的序列是示例性的。非限制性示例包括NP_005182.1：

MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELAQTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREHLAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAVSSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPRCRERRRNERL RRESVRPV。

在B7.1作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“CCL19”(也被称为ELC、CKb11、MIP3B、MIP-3b、SCYA19)是指与该名称相关的特定分子，以及与CCL19具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了CCL19序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000009.11NC_018920.2NT_008413.19、NP_006265.1相关的序列是示例性的。非限制性示例包括NP_006265.1：

MALLLALSLL VLWTSPAPTL SGTNDAEDCC LSVTQKPIPG YIVRNFHYLL IKDGCRVPAVVFTTLRGRQL CAPPDQPWVE RIIQRLQRTS AKMKRRSS。

在CCL19作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“CCL20”(也被称为CKb4、LARC、ST38、MIP3A、Exodus、MIP-3a、SCYA20、MIP-3-alpha)是指与该名称相关的特定分子，以及与CCL20具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了CCL20序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000002.11NC_018913.2NT_005403.18、NP_001123518.1和NP_004582.1相关的序列是示例性的。非限制性示例包括NP_004582.1：

MCCTKSLLLA ALMSVLLLHL CGESEAASNF DCCLGYTDRI LHPKFIVGFT RQLANEGCDINAIIFHTKKK LSVCANPKQT WVKYIVRLLS KKVKNM

以及NP_001123518.1：

MCCTKSLLLA ALMSVLLLHL CGESEASNFD CCLGYTDRIL HPKFIVGFTR QLANEGCDINAIIFHTKKKL SVCANPKQTW VKYIVRLLSK KVKNM。

在CCL20作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(网址：http://www.linscottsdirectory.com/，上次访问时间为2019年6月20日)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“CD40L”(也被称为IGM、IMD3、TRAP、gp39、CD154、CD40LG、HIGM1、T-BAM、TNFSF5、hCD40L)是指与该名称相关的特定分子，以及与CD40L具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了CD40L序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000023.10、NC_018934.2、NT_011786.17、NP_000065.1相关的序列是示例性的。非限制性示例包括NP_000065.1：

MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL DKIEDERNLHEDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDIML NKEETKKENS FEMQKGDQNP QIAAHVISEASSKTTSVLQW AEKGYYTMSN NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY IYAQVTFCSN REASSQAPFI ASLCLKSPGRFERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE LQPGASVFVN VTDPSQVSHG TGFTSFGLLK L。

在CD40L作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(网址：http://www.linscottsdirectory.com/，上次访问时间为2019年6月20日)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“CD137L”(也被称为TNFSF9、4-1BB-L)是指与该名称相关的特定分子，以及与CD137L具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了CD137L序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000019.9、NT_011295.12、NC_018930.2和NP_003802.1相关的蛋白质序列是示例性的。非限制性示例包括NP_003802.1：

MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL LAAACAVFLA CPWAVSGARASPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDTKELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE。

在CD137L作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(网址：http://www.linscottsdirectory.com/，上次访问时间为2019年6月20日)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“GITRL”(也被称为TNFSF18、TL6、AITRL、hGITRL)是指与该名称相关的特定分子，以及与GITRL具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了GITRL序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000001.10、NC_018912.2、NT_004487.20和NP_005083.2相关的蛋白质序列是示例性的。非限制性示例包括NP_005083.2：

MTLHPSPITC EFLFSTALIS PKMCLSHLEN MPLSHSRTQG AQRSSWKLWL FCSIVMLLFLCSFSWLIFIF LQLETAKEPC MAKFGPLPSK WQMASSEPPC VNKVSDWKLE ILQNGLYLIY GQVAPNANYNDVAPFEVRLY KNKDMIQTLT NKSKIQNVGG TYELHVGDTI DLIFNSEHQV LKNNTYWGII LLANPQFIS。

在GITRL作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(网址：http://www.linscottsdirectory.com/，上次访问时间为2019年6月20日)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“GM-CSF”(也被称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、CSF2)是指与该名称相关的特定分子，以及与GM-CSF具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了GM-CSF序列的实例。另外，与UniProt参考编号P04141-CSF2_HUMAN相关的蛋白质序列：

MWLQSLLLLG TVACSISAPA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVISEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDFLLVIPFDCWE PVQE。

在GM-CSF作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“IL-12”(也被称为“白介素12”)是指与该名称相关的特定分子，以及与IL-12具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了IL-12序列的实例，包括但不限于成熟形式的IL-12及其变体和片段，例如单链IL-12、IL-12A(GenBank登录号NC_000003.11NT_005612.17NC_018914.2)和IL-12B(GenBank登录号NC_000005.9NC_018916.2NT_023133.14)。与美国专利号8,556,882中公开的序列相关的蛋白质序列是示例性的。在IL-12作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“IL-2”(也被称为“白介素2”)是指与该名称相关的特定分子，以及与IL-2具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。以下非限制性示例提供了天然人IL-2的全长序列：

APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIISTLT。

术语“低毒性IL-2”是指当施用于对象时表现出相似生物学功能但毒性较低的IL-2的修饰形式。在一些实施方案中，低毒性IL-2包含与野生型IL-2相比具有降低的血管通透性的突变。美国专利号7,371,371公开了在人IL-2的氨基酸位置22至58之间的野生型IL-2的通透性增强区域中的示例性突变。非限制性实例包括人序列中第38位的R至W的突变。美国专利号7,371,371进一步公开了低毒性IL-2，其在IL-2的通透性增强区域之外的一个或多个位置处包含突变。

如本文使用的，术语“IL-15”(也被称为“白介素15”)是指与该名称相关的特定分子，以及与IL-15具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了IL-15序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000004.11、NC_018915.2、NT_016354.20、NP_000576.1、NP_751915.1相关的蛋白质序列是示例性的。在IL-15作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory ofImmunological&Biological Reagents(http://www.linscottsdirectory.com/)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“IL-18”(也被称为“白介素18”、IGIF、“白介素1γ”、IL1F4、IFN-γ诱导因子、IL-1g)是指与该名称相关的特定分子，以及与IL-18具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了IL-18序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000011.9、NC_018922.2、NT_033899.9、NP_001230140.1、NP_001553.1相关的蛋白质序列是示例性的。在IL-18作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&Biological Reagents(参见上述linscottsdirectory.com)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“IL-21”(也被称为“白介素21”、Za11、CVID11)是指与该名称相关的特定分子，以及与IL-21具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了IL-21序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000004.11、NC_018915.2、NT_016354.20相关的蛋白质序列是示例性的。在IL-21作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&Biological Reagents(参见上述linscottsdirectory.com)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“LEC”(也被称为CCL16、LMC、NCC4、CKb12、HCC-4、LCC-1、Mtn-1、NCC-4、SCYL4、ILINCK、SCYA16)是指与该名称相关的特定分子，以及与LEC具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了LEC序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000017.10、NT_010783.16、NT_187614.1、NC_018928.2,NP_004581.1相关的蛋白质序列是示例性的。非限制性示例包括NP_004581.1：MKVSEAALSL LVLILIITSA SRSQPKVPEW VNTPSTCCLKYYEKVLPRRL VVGYRKALNC HLPAIIFVTK RNREVCTNPN DDWVQEYIKD PNLPLLPTRN LSTVKIITAKNGQPQLLNSQ。

在LEC作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(参见上述linscottsdirectory.com)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“OX40L”(也被称为TNFSF4、GP34、CD252、TXGP1、CD134L、OX-40L)是指与该名称相关的特定分子，以及与OX40L具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。本文提供了OX40L序列的实例。另外，与GenBank登录号NC_000001.10、NT_004487.20、NC_018912.2、NP_003317.1相关的蛋白质序列是示例性的。

非限制性示例包括NP_003317.1:MERVQPLEEN VGNAARPRFE RNKLLLVASVIQGLGLLLCF TYICLHFSAL QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGFYLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGELILIHQNPGEF CVL。

在OX40L作为组合物的一部分施用的一些实施方案中，它可以是合成的或从任何可获得的商业来源购买。此类来源包括Santa Cruz Biosciences,Origene和纯化蛋白质及其修饰形式的其他卖方。可以在Linscott’s Directory of Immunological&BiologicalReagents(参见上述linscottsdirectory.com)上找到商业来源清单。

如本文使用的，术语“FLT3”是指与该名称、任何其替代名称(Fms相关酪氨酸激酶、干细胞酪氨酸激酶、Fms样酪氨酸激酶、FL细胞因子受体、CD135抗原、EC2.7.10.1、CD135、FLK-2、STK1、FLK2、生长因子受体酪氨酸激酶III型、受体型酪氨酸蛋白激酶FLT3、胎肝激酶2、胎肝激酶-2、EC 2.7.10、FLT-3、STK-1)或UniProt登录号P36888相关的受体型酪氨酸蛋白激酶FLT3，以及与FLT3具有至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子及其任何变体或同种型。FLT3的非限制性示例包括：人类FLT3同种型1,

MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSNYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS，以及任选的其等效物。

人类FLT3同种型2:

MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS，以及任选的其等效物。

如本文所用，术语FLT3-1是指包含具有CDR的氨基酸序列的抗体，所述CDR与在下文公开的重链和轻链多核苷酸序列中编码的CDR中的任何一个(优选CDR3区中的至少一个，最优选以下两个CDR3区)具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。所述CDR区的氨基酸序列也在下文公开。

FLT3-1重链可变区序列：

CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA，以及任选的其等效物。

FLT3-1轻链可变区序列：

GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG，以及

任选的其等效物。

FLT3-1 CDHR1:

SYWMH，以及任选的其等效物。

FLT3-1 CDHR2:

EIDPSDSYKDYNQKFKD，以及任选的其等效物。

FLT3-1 CDHR3:

AITTTPFDF，以及任选的其等效物。

FLT3-1 CDLR1:

RASQSISNNLH，以及任选的其等效物。

FLT3-1 CDLR2:

YASQSIS，以及任选的其等效物。

FLT3-1 CDLR3:

QQSNTWPYT，以及任选的其等效物。

如本文所用，术语FLT3-2是指包含具有CDR的氨基酸序列的抗体，所述CDR与在下文公开的重链和轻链多核苷酸序列中编码的CDR中的任何一个(优选CDR3区中的至少一个，最优选以下两个CDR3区)具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。所述CDR区的氨基酸序列也在下文公开。

FLT3-2重链可变区序列：

CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA，以及任选的其等效物。

FLT3-2轻链可变区序列：

GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG，以及任选的其等效物。

FLT3-2 CDHR1:

NYGLH，以及任选的其等效物。

FLT3-2 CDHR2:

VIWSGGSTDYNAAFIS，以及任选的其等效物。

FLT3-2 CDHR3:

GGIYYANHYYAMDY，以及任选的其等效物。

FLT3-2 CDLR1:

KSSQSLLNSGNQKNYM，以及任选的其等效物。

FLT3-2 CDLR2:

GASTRES，以及任选的其等效物。

FLT3-2 CDLR3:

QNDHSYPLT，以及任选的其等效物。

如本文所用，术语“FLT3抑制剂”是指结合FLT3并降低其活性的分子。不受理论的束缚，相信此类FLT3抑制剂可增加细胞上表面FLT3的表达。FLT3抑制剂的非限制性例子包括gilteritinib(Astellas)、奎扎替尼(Ambit Biosciences)、米哚妥林(Novartis)、sorafenib(Bayer and Onxy Pharmaceuticals)、舒尼替尼(Pfizer)、lestarutinib(Cephalon)、FF-10101(Fuijfilm)、多韦替尼(Novartis或Oncology Venture)及其等效物，例如但不限于盐和水合物。下面提供了这些示例性FLT3抑制剂中的一些的示例性结构：

如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T-体(T-body)”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”意为能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”意为已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。在某些实施方案中，除了主要的信号传导结构域外，细胞内结构域可以包含一个或多个共刺激信号传导结构域，或基本上由其组成，或进一步由其组成。“跨膜结构域”意为已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链(hinge)结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的连接子。在本文中公开了编码每个结构域的组分的非限制性的示例性多核苷酸序列，例如：

铰链结构域：IgG1重链铰链序列：

CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG，以及任选的其等效物。

铰链结构域：IgG1重链铰链氨基酸序列：

LEPKSCDKTHTCPPCP，以及任选的其等效物。

跨膜结构域：CD28跨膜结构域：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG，以及任选的其等效物。

跨膜结构域：CD28跨膜区氨基酸序列：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV，以及任选的其等效物。

细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG，以及任选的其等效物。

细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域氨基酸序列：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL，以及任选的其等效物。

细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域：

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC，以及任选的其等效物。

细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域氨基酸序列：

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS，以及任选的其等效物。

细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA，以及任选的其等效物。

细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域氨基酸序列：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，以及任选的其等效物。

每个示例性结构域组分的其他实施方案包括与由以上公开的核酸序列编码的蛋白质具有至少70％、或至少80％的氨基酸序列同一性、优选90％的序列同一性、或者至少95％的序列同一性的具有相似生物学功能的其他蛋白质。此外，本文提供了此类结构域的非限制性实例。

如本文使用的，术语“连接子/接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包含1至10个、或替代性地8个氨基酸、或替代性地6个氨基酸、或替代性地5个氨基酸，并且可以被重复1至10次、或替代性地约8次、或替代性地约6次、或替代性地约5次、或4次、或替代性地3次、或替代性地2次。例如，接头可以包含由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一方面，接头序列是包含三次重复的gly-gly-gly-gly-ser的(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头(以单字母序列表示法表示为GGGGS)。

如本文使用的，术语“CD8α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8α铰链结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在Pinto,R.D.et al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的CD8α铰链结构域的示例性序列。

在Pinto,R.D.et al.(2006)Vet.Immunol.Immunopathol.110:169-177中提供了与CD8α铰链结构域相关的序列。这种非限制性的实施例包括：

人CD8α铰链结构域：

PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY，以及任选的其等效物。

小鼠CD8α铰链结构域：

KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY，以及任选的其等效物。

猫CD8α铰链结构域：

PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY，以及任选的其等效物。

如本文使用的，术语“CD8α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8α跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链的183至203位氨基酸(NCBI参考序列：NP_001759.3)、或者小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的197至217位氨基酸(NCBI参考序列：NP_001074579.1)、以及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的190至210位氨基酸(NCBI参考序列：NP_113726.1)相关的片段序列，提供了CD8α跨膜结构域的其他的示例性序列。与每个列出的登录号相关的序列提供如下：

人CD8α跨膜结构域：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT，以及任选的其等效物。

小鼠CD8α跨膜结构域：IWAPLAGICVALLLSLIITLI，以及任选的其等效物。

大鼠CD8α跨膜结构域：IWAPLAGICAVLLLSLVITLI，以及任选的其等效物。

如本文使用的，术语“4-1BB共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的4-1BB共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号20130266551A1中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的非限制性示例性序列，例如以下提供的示例性序列：

4-1BB共刺激信号传导区域：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL，以及任选的其等效物。

如本文使用的，术语“ICOS共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的ICOS共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下：ICOS共刺激信号传导区域：

ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGAGCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA，以及任选的其等效物。

ICOS共刺激信号传导区域氨基酸序列：

TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL，以及任选的其等效物。

如本文使用的，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的OX40共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，其包括以下提供的示例性序列。

OX40共刺激信号传导区域：

AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGACCCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC，以及任选的其等效物。

OX40共刺激信号传导区域氨基酸序列：

RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI，以及任选的其等效物。

如本文使用的，术语“CD28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列，提供了CD28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。

如本文使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；Geiger,T.L.et al.,Blood 98:2364-2371(2001)；Hombach,A.et al.,J Immunol 167:6123-6131(2001)；Maher,J.et al.NatBiotechnol 20:70-75(2002)；Haynes,N.M.et al.,J Immunol 169:5780-5786(2002)；Haynes,N.M.et al.,Blood 100:3155-3163(2002)中提供了示例性的CD28共刺激信号传导区域。非限制性的实施例包括以下CD28序列的114-220残基：

MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS，及其等效物。

如本文使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号8,399,645中提供了CD3ζ信号传导结构域的非限制性示例性序列，例如：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

如本文使用的，术语“自杀基因”是能够诱导细胞凋亡的基因；非限制性实施例包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素P450或PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的EGFR或诱导型胱天蛋白酶(“iCasp”)。自杀基因可以根据多种途径起作用，并且在一些情况下，可以由例如小分子的诱导剂诱导。例如，iCasp自杀基因包含可操作地连接至被优化为与诱导剂结合的蛋白的半胱天冬酶蛋白酶蛋白的一部分；将诱导剂引入包含自杀基因的细胞中导致半胱天冬酶蛋白酶的活化和所述细胞的随后凋亡。

术语“FKBP”或FK506结合蛋白是指具有脯氨酰异构酶活性并与亲环蛋白功能相关的蛋白家族。从酵母到人类的许多真核生物中均已鉴定出FKBP，它们可作为含有脯氨酸残基的蛋白质的折叠蛋白伴侣。与亲环蛋白一起，FKBP也属于亲免蛋白家族。非限制性示例性的FKBP是人FKBP12(也被称为FKBP1A)，UniProt的参考编号P62942。FKBP的其他非限制性实例包括由GenBank登录号AH002818、BC119732.1、NM_001199786.1和NM_054014.3提供的那些。

如本文所用，术语“T2A”和“2A肽”可互换使用，是指任何2A肽或其片段、任何2A样肽或其片段、或在包含共有多肽基序D-V/I-E-X-N-P-G-P(其中X表示通常被认为是自我切割的任何氨基酸)的相对较短的肽序列(取决于起源病毒，其长度约为20个氨基酸)中包含必需氨基酸的人工肽。

术语“转导”或“转染”在其被应用至嵌合抗原受体细胞的产生时是指外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方案中，该转导是通过载体完成的。

“组合物”通常是指活性剂(例如化合物或组合物)和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的(例如可检测试剂或标签)或活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地占1-99.99％。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA))、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也意在本技术的范围之内，其实施例包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。

如本文使用的，“癌症”是一种疾病状态，其特征是在对象中存在表现出异常的不受控制的复制的细胞，并且可以与术语“肿瘤”互换地使用。在一些实施方案中，癌症是白血病或淋巴瘤。在某些实施方案中，癌症是急性髓细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病。如本文所用，“白血病”是特征在于未成熟白细胞异常增加的血液或骨髓癌。急性髓细胞性白血病(AML)(也称为急性骨髓性白血病或急性粒细胞性白血病)的特定病状是髓样来源血细胞的癌症，其特征是异常骨髓样细胞迅速生长，这些异常髓样细胞积聚在骨髓中并干扰骨髓与正常血细胞的产生。急性淋巴细胞性白血病(ALL)的特殊情况(也称为急性淋巴细胞性白血病或急性淋巴样白血病)是白细胞癌，其特征是恶性、未成熟白细胞(淋巴细胞)的过量生成和积累，导致缺乏正常、健康的血细胞。如本文所用，“淋巴瘤”是血液癌症，其特征在于血细胞瘤的发展和淋巴结肿大、发烧、湿汗、意外体重减轻、瘙痒和经常感到疲倦的症状。

“实体肿瘤”是通常不包含囊肿或液体区域的异常的组织块。实体肿瘤可以是良性的或恶性的、转移性或非转移性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的实施例包括肉瘤、癌和淋巴瘤。

“对应于癌组织类型的正常细胞”是指来自与癌组织相同组织类型的正常细胞。非限制性实例是来自患者例如患有白血病的患者的正常白细胞。

如本文使用的，“治疗”或“处理”在对象中的疾病是指(1)防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展或复发；或者(3)改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症(包括疾病)的程度的降低，病症(包括疾病)的稳定化(即不恶化)状态，病症(包括疾病)的延迟或减缓，病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。包含所公开的组合物和方法的治疗可以是一线、二线、三线、四线、五线疗法，并且意在用作单独疗法或与其他合适的疗法组合。在一方面，“治疗”不包括预防。当疾病是癌症时，以下临床终点是治疗的非限制性实施例：减少肿瘤负荷、减慢肿瘤生长、更长的总生存期、更长的肿瘤进展时间、抑制转移或减少肿瘤的转移。

短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。

“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。

如本文所用，“细胞还原疗法”包括但不限于化学疗法、冷冻疗法和放射疗法。起到减少细胞增殖作用的药剂是本领域已知的并且被广泛使用。仅在分裂时杀死癌细胞的化学疗法药物被称为细胞周期特异性。这些药物包括在S期起作用的药物，包括拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。

拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶I和II)的作用的药物。在化学治疗过程中，拓扑异构酶控制复制所需的DNA结构的操纵，因此具有细胞周期特异性。拓扑异构酶I抑制剂的实例包括上面列出的喜树碱类似物、伊立替康和托泊替康。拓扑异构酶II抑制剂的例子包括氨苄青霉素(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷(teniposide)。

抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，经常干扰涉及染色体复制的过程。他们在周期的特定阶段攻击细胞。抗代谢药物包括：叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、呋喃核苷、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他滨；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉拉滨和喷司他丁；等等。

植物生物碱衍生自某些类型的植物。长春花生物碱由长春花植物(Catharanthusrosea)制成。紫杉烷是从太平洋紫杉树(红豆杉)的树皮制成的。长春花生物碱和紫杉烷类也被称为抗微管剂。鬼臼毒素来自五月苹果植物。喜树碱类似物源自亚洲的“快乐树”(Camptotheca acuminata)。鬼臼毒素和喜树碱类似物也归类为拓扑异构酶抑制剂。植物生物碱通常是细胞周期特异性的。

这些试剂的实例包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼索德；以及喜树碱类似物，例如伊立替康和托泊替康。

冷冻疗法包括但不限于涉及降低温度的疗法，例如低温疗法。

放射疗法包括但不限于暴露于放射线，例如本领域已知的电离辐射、UV辐射。示例性剂量包括但不限于至少约2Gy至不超过约10Gy的电离辐射剂量和/或至少约5J/m

如本文所用，术语“造血作用”是指对象在骨髓中产生血细胞和/或血小板的能力。术语“正常造血”可以指对象的造血基线水平和/或基于不患有影响造血功能的疾病或病症(例如但不限于血液或骨髓癌)的对象群体产生的血细胞和/或血小板的平均水平的正常造血的临床可接受阈值。因此，如本文所用，术语“维持正常造血”是指对象在干预期间或之后维持指定的正常水平的能力，而术语“恢复正常造血”是指对象在干预期间或之后恢复至指定的正常水平的能力。

如本文所用，术语“CD34”是指在多种细胞上表达的蛋白质，所述细胞包括但不限于造血细胞和与基因卡ID GC01M207880相关的树突状细胞的亚群。人CD34的非限制性示例性蛋白质序列可以在UniProt参考编号P28906中找到；小鼠CD34，UniProt参考编号Q64314。“CD34+”细胞是检测到具有CD34表面表达的那些细胞。非限制性的示例性CD34+细胞包括能够自我更新、增殖和分化为Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-区室中的髓样、淋巴样和红细胞系的祖细胞的造血干细胞；这些细胞对于造血细胞的植入至关重要，也被称为FLT3+。参见Bhatia et al.(1997)PNAS 94(10):5230-5235；Notta et al.(2010)Blood 115(18):3074-3077；Kikushige et al.(2008)J.Immunol.180(11):7358-7367。

如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本公开中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80％的存在于制剂中的所有大分子种类。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90％、通常大于95％的存在于纯化制剂中的所有大分子种类。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子种类不能通过常规技术而被检测到。

如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接产生可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光产生可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团(例如荧光剂、发光染料)、带有通过电子显微镜或通过其电性质(例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗)检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法(例如原子力谱、隧道效应)、或放射性分子(例如

如本文使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃、硫氧还蛋白、聚(NANP)、V5，Snap、HA、几丁质结合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃红、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、得克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。

如本文使用的，术语“载体”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方案中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方案中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等产生病毒载体。在一个实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。如本文所用，术语“多顺反子的”在涉及载体时是指包含多个编码区(外显子)的载体，例如单顺反子(具有一个编码区)、双顺反子(具有两个编码区)和三顺反子(具有三个编码区)。

与以上列出的GenBank登录号、UniProt参考号、其他参考ID号和参考文献中的每一个相关联的序列通过引用并入本文。

缩略语表

AML：急性髓细胞性白血病

ALL：急性淋巴细胞白血病

CAR：嵌合抗原受体

iCasp：诱导的半胱天冬酶。

用于实施本公开的模式

由于最近使用基因改造的嵌合抗原受体(CAR)T细胞的自体治疗在B细胞淋巴瘤和白血病中获得了空前的结果(Maude,S.L.et al.(2014)New Engl.J.Med.371:1507-1517；Porter,D.L.et al.(2011)New Engl.J.Med.365:725-733)，许多实验室已开始将此方法应用于包括卵巢癌、前列腺癌和胰腺肿瘤在内的实体瘤。CAR修饰的T细胞将单克隆抗体的HLA非依赖性靶向特异性与活化T细胞的细胞溶解活性、增殖和归巢特性结合在一起，但不响应检查点抑制。由于其可直接杀死表达抗原的靶标的能力，因此CAR T细胞对任何抗原阳性细胞或组织都具有高毒性，因此需要构建具有高度肿瘤特异性抗体的CAR。迄今为止，针对人实体瘤的CAR修饰的T细胞已经针对α叶酸受体、间皮素、MUC-CD、PSMA和其他靶标构建；但大多数在正常组织中有一些脱靶抗原的表达。这些构建体未在患者中显示出相同的优异结果，强调需要进行更多研究以鉴定可用于对抗实体瘤和其他癌症的CAR T细胞构建的新靶标和方法。本公开满足了这些挑战。申请人已经发现，长时间培养的CAR NK细胞或NK细胞表达大量的检查点蛋白PD-1，这是对癌症患者NK细胞的抑制信号，而AML胚细胞在细胞表面表达PD-L1。从该先前的双特异性平台和其他组来看，双特异性抗体(“biAb”)的主要问题是半衰期短，从而限制了生物利用度和功效。因此，申请人寻求克服该技术限制，并通过增加参与、增加激活和拮抗检查点抑制来提供针对AML的协同溶细胞活性。

因此，本公开提供了一种或多种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的多核苷酸和/或载体，所述嵌合抗原受体包括：1)对FLT3特异性的结合域，在某些方面，其是FLT3抗体的抗原结合域，以及2)识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域。本文进一步提供了涉及其使用和生产的方法和组合物。

嵌合抗原受体及其用途

CAR的组分

本公开内容提供了与FLT3结合的嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含细胞激活部分，包含细胞外、跨膜和细胞内结构域，或基本上由其组成，或由其组成。细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，或称为抗原结合结构域。在一方面，细胞内结构域或细胞质结构域包含共刺激信号传导区域和ζ链部分。CAR可以任选地进一步包含至多300个氨基酸、优选10至100个氨基酸、更优选25至50个氨基酸的间隔域。

间隔域。CAR可以任选地进一步包含至多300个氨基酸、优选10至100个氨基酸、更优选25至50个氨基酸的间隔域。例如，间隔域可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。间隔域可以包括例如人Fc域、CH3域或任何免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其变体)的铰链区的一部分。例如，一些实施方案可以包含具有或不具有S228P、L235E和/或N297Q突变(根据Kabat编号)的IgG4铰链。其他间隔域包括但不限于CD4、CD8和CD28铰链区。

抗原结合结构域。本发明的CAR包含FLT3抗体或结合FLT3的抗体(即完整抗体)的抗原结合结构域。特异性结合FLT3的单克隆抗体可从例如Becton Dickinson Biosciences和其他商业来源商购获得，例如在以下网址列出的那些：biocompare.com/Search-Antibodies/？search＝FLT3&said＝0。制备抗原结合片段的方法是本领域已知的，并且在本文中进行了简要描述。抗原结合结构域可以来自任何合适的物种，例如绵羊或人。

在一方面，抗原结合结构域包含FLT3抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含靶标特异性抗体(例如抗FLT3抗体)的片段，例如scFv，或基本上由其组成，或由其组成。scFv区可以包含与短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(V

在一些实施方案中，重链可变区包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或基本上由其组成，或由其组成：

在其他实施方案中，重链可变区包含以下多肽序列，或基本上由其组成，或由其组成：

QVQLQQPGAELVKPGASLKLSCKSSGYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLTVDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDFWGQGTTLTVSS，或其抗原结合片段或等效物。

在一些实施方案中，重链可变区包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或基本上由其组成，或由其组成：

在其他实施方案中，重链可变区包含以下多肽序列，或基本上由其组成，或由其组成：

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGLHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARKGGIYYANHYYAMDYWGQGTSVTVSS，或其抗原结合片段或等效物。

在一些实施方案中，重链可变区包含的CDRH1序列包含以SYWMH、NYGLH或其每个的等效物开头，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代性地约40个氨基酸、或替代性地约30个氨基酸、或替代性地约20个氨基酸、或替代性地约10个氨基酸、或替代地性约5个氨基酸、或替代性地约4、或3、或2或1个氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，重链可变区包含的CDRH2序列包含以EIDPSDSYKDYNQKFKD、VIWSGGSTDYNAAFIS或其每个的等效物开头，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代性地约40个氨基酸、或替代性地约30个氨基酸、或替代性地约20个氨基酸、或替代性地约10个氨基酸、或替代地性约5个氨基酸、或替代性地约4、或3、或2或1个氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，重链可变区包含的CDRH3序列包含以AITTTPFDF、GGIYYANHYYAMDY或其每个的等效物开头，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代性地约40个氨基酸、或替代性地约30个氨基酸、或替代性地约20个氨基酸、或替代性地约10个氨基酸、或替代地性约5个氨基酸、或替代性地约4、或3、或2或1个氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，轻链可变区包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或基本上由其组成，或由其组成：

在其他实施方案中，轻链可变区包含以下多肽序列，或基本上由其组成，或由其组成：

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYTFGGGTKLEIKR，或其抗原结合片段或等效物。

在一些实施方案中，轻链可变区包含由以下多核苷酸序列编码的多肽，或基本上由其组成，或由其组成：

在其他实施方案中，轻链可变区包含以下多肽序列，或基本上由其组成，或由其组成：

DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYMAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPLTFGAGTKLELKR，或其抗原结合片段或等效物。

在一些实施方案中，轻链可变区包含的CDRL1序列包含以RASQSISNNLH、KSSQSLLNSGNQKNYM或其每个的等效物开头，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代性地约40个氨基酸、或替代性地约30个氨基酸、或替代性地约20个氨基酸、或替代性地约10个氨基酸、或替代地性约5个氨基酸、或替代性地约4、或3、或2或1个氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，轻链可变区包含的CDRL2序列包含以YASQSIS、GASTRES或其每个的等效物开头，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代性地约40个氨基酸、或替代性地约30个氨基酸、或替代性地约20个氨基酸、或替代性地约10个氨基酸、或替代地性约5个氨基酸、或替代性地约4、或3、或2或1个氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，轻链可变区包含的CDRL3序列包含以QQSNTWPYT、QNDHSYPLT或其每个的等效物开头，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代性地约40个氨基酸、或替代性地约30个氨基酸、或替代性地约20个氨基酸、或替代性地约10个氨基酸、或替代地性约5个氨基酸、或替代性地约4、或3、或2或1个氨基酸的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在本技术的另一方面，FLT3抗体的抗原结合结构域包括以下特征中的一个或多个：

(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少80％相同的一个或多个CDR；

(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包含与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少80％相同的一个或多个CDR；

(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少80％相同；

(d)HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少80％相同；以及

(e)所述抗体结合的表位与被公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。

等效物的其他实例包括与该肽具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％的氨基酸同一性的肽，或者由在高严格条件下与编码抗原结合域的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；大约1xSSC至大约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1xSSC或去离子水的洗涤溶液。

示例性的抗原结合结构域可以包含以下所述的肽中的一个或多个，并且在一方面可以包含针对表1中公开的特定抗原的所述HC和LC的所有三个CDR或编码在以下表1中提供的FLT3 HC和LC可变区的多核苷酸。

表1

FLT3-1重链可变区多核苷酸序列：

FLT3-1轻链可变区多核苷酸序列：

FLT3-2重链可变区多核苷酸序列：

FLT3-2轻链可变区多核苷酸序列：

FLT3 CDR结构域氨基酸序列的其他非限制性实例描述于：美国专利申请号US20180346601的表1-4，美国专利申请号US20180037657的表V，美国专利申请号US20170037149的表10，美国专利申请号US20160272716的表V，美国专利申请号US20110091470的表1-3和美国专利申请号US20090297529的表1-3。

FLT3重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的非限制性实例描述于：美国专利申请号US20180346601的表1和3，美国专利申请号US20180037657的表X，美国专利申请号US20170037149的表10和美国专利申请号US20160272716的表VII。

在一方面，本公开提供了抗体的抗原结合结构域，其与FLT3-1至少80％、或85％、或90％、或95％、或至少97％相同。等效物的其他实例包括由在高严格条件下与编码抗原结合域核酸序列的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；大约1x SSC至大约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。

在本文提供的抗体的一些方面，HC可变域序列包含FLT3-1的可变域序列，而LC可变域序列包含FLT3-1的可变域序列。

在一方面，本公开提供了包含FLT3-1的CDR的抗体的抗原结合结构域。在一方面，本公开提供了抗体的抗原结合结构域，其与FLT3-1的CDR、或由在高严格条件下与编码FLT3CDR的核酸序列的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽至少85％、或80％、或85％、或90％、或95％、或至少97％相同，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；大约1x SSC至大约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。

在一方面，本公开提供了抗体的抗原结合结构域，其与FLT3-2至少80％、或85％、或90％、或95％、或至少97％相同。等效物的其他实例包括由在高严格条件下与编码抗原结合域核酸序列的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；大约1x SSC至大约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。

在本文提供的抗体的一些方面，HC可变域序列包含FLT3-2的可变域序列，而LC可变域序列包含FLT3-2的可变域序列。

在一方面，本公开提供了包含FLT3-2的CDR的抗体的抗原结合结构域。在一方面，本公开提供了抗体的抗原结合结构域，其与FLT3-2的CDR、或由在高严格条件下与编码FLT3CDR的核酸序列的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽至少85％、或80％、或85％、或90％、或95％、或至少97％相同，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；大约1x SSC至大约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。

跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在来源是天然的情况中，结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本公开中的特定用途的跨膜区域可以衍生自CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCR。替代性地，跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接子(优选长度为2至10个氨基酸)可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的连接子。

细胞质结构域。CAR的细胞质结构域(胞质域)或细胞内信号传导结构域负责在其中置有CAR的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞进行其特定功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截短的部分，只要该截短的部分足够来转导效应器功能信号。T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在CAR中使用。具有在本公开中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。在一些实施方案中，CAR的信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域。

因为通过TCR产生的信号单独不足以进行T细胞的完全激活，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，至少一个共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、或特异性地与CD83结合的配体也可以被包括在CAR的细胞质结构域中。例如，除了信号传导结构域(例如，CD3ζ信号传导结构域)之外，CAR可以包含一个、两个或更多个共刺激结构域。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是T细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段，或基本上由其组成，或由其组成：CD8蛋白、CD28蛋白、4-1BB蛋白、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD27、LIGHT、NKG2C、B7-H3和CD3ζ蛋白。

在具体的实施方案中，CAR包含以下序列、或基本上由其组成、或由其组成：FLT3抗体的抗原结合结构域(例如scFv)、铰链结构域、CD8α跨膜结构域、共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方案中，共刺激信号传导区域包含CD28共刺激信号传导区域和4-1BB共刺激信号传导区域中的一个或两个。

开关机制。在一些实施方案中，CAR还可以包含用于控制CAR的表达和/或激活的开关机制。例如，CAR可以包含细胞外、跨膜和细胞内结构域，或由其组成，或基本上由其组成，其中所述细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，该靶标特异性结合元件包含对在靶细胞上或由靶细胞表达的靶抗原以外的分子具有特异性的标记、结合域或标签。在这样的实施方案中，CAR的特异性由第二构建体提供，所述第二构建体包含靶抗原结合结构域(例如，抗FLT3抗体或其抗原结合片段或与FLT3和CAR上的标记或标签结合的双特异性抗体)和被CAR上的标记、结合结构域或标签识别或结合的结构域，或由其组成，或基本上由其组成。参见例如WO 2013/044225、WO 2016/000304、WO 2015/057834、WO 2015/057852、WO 2016/070061、US 9,233,125、US 2016/0129109。以这种方式，表达CAR的T细胞可以被施用于对象，但是在施用包含FLT3特异性结合结构域的第二组合物之前，其不能结合其靶抗原(即，FLT3)。

本公开的CAR可能同样需要多聚化以激活其功能(参见例如US 2015/0368342、US2016/0175359、US 2015/0368360)和/或外源信号(例如小分子药物)(US 2016/0166613、Yung et al.,Science,2015)来引发T细胞应答。

此外，公开的CAR可以包含“自杀开关”(也称为“自杀基因”)，以在治疗后诱导CAR细胞的细胞死亡(Buddee et al.,PLoS One,2013)或在与靶抗原结合后下调CAR的表达(WO2016/011210)。非限制性示例性自杀开关或自杀基因是iCasp。自杀开关可以在诱导型启动子的指导下。

在一方面，本公开的CAR可以进一步包含可诱导的或组成型活性元件，或基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方案中，可诱导的或组成型活性元件控制编码免疫调节分子或细胞因子的多核苷酸的表达。免疫调节分子或细胞因子可以包含以下中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、LEC和/或OX40L。在另一方面，免疫调节分子或细胞因子可以包含以下因子，或基本上由其组成，或由其组成：IL-12和/或GM-CSF；和/或IL-12和/或IL-2和低毒性IL-2中的一种或多种；和/或IL-12和/或IL-15；和/或IL-12和/或IL-21；IL-12和/或B7.1；和/或IL-12和/或OX40L；和/或IL-12和/或CD40L；和/或IL-12和/或GITRL；和/或IL-12和/或IL-18；和/或IL-2和低毒性IL-2中的一种或多种以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或IL-15和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或IL-21以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或GM-CSF以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或OX40L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或CD137L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或包含B7.1和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或CD40L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或GITRL以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种。

在一些实施方案中，CAR可以进一步包含可检测标记或纯化标记。在另一方面，本文所述的CAR包含在组合物中，例如用于诊断或治疗的药学上可接受的载体。

抗体和制备FLT3、PD-1和PD-L1抗体的方法

本文进一步提供了抗体，其包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，该单链可变片段序列包含氨基酸序列(Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S VK V S C K A S G Y T F T N Y Y M Y W V R Q A P G Q G L E W M G G I N P S N G GT N F N E K F K N R V T L T T D S S T T T A Y M E L K S L Q F D D T A V Y Y CA R R D Y R F D M G F D Y W G Q G T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G SD I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D V S T A V A W Y Q Q KP G K A P K L L I Y S A S F L Y S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S LQ P E D F A T Y Y C Q Q Y L Y H P A T F G Q G T K V E I K R)或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，包含单链可变片段序列(scFv)或基本上由其组成或由其组成的抗体由包含以下核酸序列或基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列编码：

(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGEAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK)或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，包含单链可变片段序列(scFv)或基本上由其组成或由其组成的抗体由包含以下核酸序列或基本上由其组成或由其组成的核苷酸序列编码：

(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGEAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK)或其每一个的等效物。在一方面，双特异性抗体包含单链可变片段序列(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，所述单链可变片段序列由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

人IgD恒定区，Uniprot:P01880

APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK

人IgG1恒定区，Uniprot:P01857

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG2恒定区，Uniprot:P01859

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG3恒定区，Uniprot:P01860

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

人IgM恒定区，Uniprot:P01871

GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY

人IgG4恒定区，Uniprot:P01861

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

人IgA1恒定区，Uniprot:P01876

ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

人IgA2恒定区，Uniprot:P01877

ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY

人Igκ恒定区，Uniprot:P01834

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

本公开还涉及抗体，其与本文所述的抗体竞争结合。本公开的抗体可以是多克隆、单克隆或人源化抗体。本文还提供了本公开的抗体的抗原结合片段。所述抗原结合片段可以选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。在一个方面，抗原结合片段可以包含以下氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

或其每一个的等效物。抗原结合片段可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含以下核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

45(Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T N Y YM Y W V R Q A P G Q G L E W M G G I N P S N G G T N F N E K F K N R V T L T TD S S T T T A Y M E L K S L Q F D D T A V Y Y C A R R D Y R F D M G F D Y W GQ G T T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S VG D R V T I T C R A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S F LY S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L YH P A T F G Q G T K V E I K R)或

(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGEAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK)或其每一个的等效物。本公开进一步涉及分离的核酸，其包含以下中的任一个核酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

本文还提供了分离的细胞，其包括本发明的抗体，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，本发明的抗体在分离的细胞中表达。该细胞可以是原核或真核细胞，并且任选地选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人细胞。在一些实施方案中，真核细胞是免疫细胞，任选地是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、或巨噬细胞。在其他实施方案中，免疫细胞是T细胞，其可以使用任何合适的系统(例如CRISPR系统)任选地被修饰以抑制内源TCR表达。在与分离的细胞有关的上述任何实施方案中，分离的细胞在细胞表面表达CAR，并分泌包含识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合域的抗体或其抗原结合片段，该抗体任选地是双特异性抗体。

可购买或使用本领域已知的和本文简要描述的方法来制备用于本公开的抗体。在某些方面，可能需要产生对由靶细胞表达的抗原特异的抗体，该靶细胞已从患者中分离出来以进行专门的个性化治疗。它们的制造和用途是众所周知的，并且在例如Greenfield(2014)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y中公开。可以使用本领域已知的标准方法来产生抗体。抗体的实例包括(但不限于)抗体的单克隆、单链和功能片段。

可以在一系列宿主(例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类等)内产生抗体。可以通过使用具有免疫原性性质的靶标抗原或其片段或寡肽(例如FLT3、PD-1或PD-L1的C末端片段或其分离的多肽)注射宿主来免疫抗体。根据宿主种类，可以添加各种佐剂用于增加免疫应答。此类佐剂包括但不限于Freund's、矿物凝胶(例如氢氧化铝)和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔戚血蓝素和二硝基苯酚)。在用于人类的佐剂中，BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)特别有用。本公开还提供了分离的多肽和佐剂。

在某些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的FLT3、PD-1或PD-L1抗体的混合物。在一个方面，所述多克隆抗体包括具有不同的CDR的多个类型的FLT3、PD-1或PD-L1抗体的混合物。因此，培养产生不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从所产生的培养物纯化出的抗体(参见WO2004/061104)。

单克隆抗体产生。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来产生抗体分子的任何技术来制备针对FLT3、PD-1或PD-L1抗原的单克隆抗体，在一方面，产生单克隆抗体以特异性结合从待治疗的对象分离的抗原。这类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如Kohler&Milstein(1975)Nature 256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见例如Kozbor et al.(1983)Immunol.Today 4:72)和EBV杂交瘤技术以产生人类单克隆抗体(参见例如Cole et al.(1985)in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以使用人杂交瘤(参见例如Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030)或者通过用EpsteinBarr病毒体外转染人B细胞(参见例如Cole et al.(1985)in:MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)来产生。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的PCR，来扩增抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段(例如可变结构域)的DNA。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白(例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白)的DNA，用于在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于FLT3、PD-1或PD-L1抗体多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代性地，可以通过例如使用包含FLT3、PD-1或PD-L1抗原的氨基酸序列或其片段(或替代性地基本上由其组成，或进一步地由其组成)的分离的多肽使对象免疫，然后使用常规方法来从所述对象的脾分离杂交瘤，制备表达FLT3单克隆抗体的杂交瘤。参见例如Milstein et al.,(Galfre and Milstein(1981)Methods Enzymol73:3-46)。使用标准方法来筛选杂交瘤将产生不同特异性(即对不同表位的特异性)和亲和力的单克隆抗体。具有期望的性质(例如FLT3、PD-1或PD-L1抗原结合)的选择的单克隆抗体可以(i)被用作通过杂交瘤来表达，(ii)被结合至例如聚乙二醇(PEG)的分子以改变其性质，或(iii)可以通过各种方法来分离、测序和操纵编码所述单克隆抗体的cDNA。在一个方面，通过杂交瘤来产生FLT3单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其中该转基因非人动物具有包含被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因(或替代性地基本上由其组成，或进一步地由其组成)的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在Greenfield(2014)Antibodies:A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Hammerling et al.(1981)Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas:563-681中教导的技术。

噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备FLT3、PD-1或PD-L1抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固体表面或珠粒的抗原，从全部的或组合的抗体文库(例如人或小鼠)中选择具有期望的结合性质的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体(filamentous phage)，包括fd和M13，其中Fab、F

Lohning的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上展示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区域可以被分离并且被用来产生整个抗体(包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段)，并且被表达在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生Fab、Fab′和F(ab′)

通常，可以针对合适的抗原来选择被克隆进展示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，从而鉴定维持良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如Barbas III et al.(2001)Phage Display,A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。然而，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体(被修饰的T7或Lambda Zap系统)以用于选择和/或筛选。

抗体产生的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或组，来产生抗体(Orlandi et al.(1989)PNAS 86:3833-3837；Winter,G.et al.(1991)Nature 349:293-299)。

替代性地，可以使用用于产生单链抗体的技术。单链抗体(scF

还可以产生抗原结合片段，例如F(ab′)

市售抗体。抗体也可以从可商购的来源购买。市售的FLT3抗体的例子包括但不限于供应商生产的，例如Proteintech Group Inc.,eBioscience,Abgent,Aviva SystemsBiology,Becton Dickinson(Biosciences),Cell Signaling Technology,FitzgeraldIndustries International,United States Biological,Biorbyt,Abbexa,Abgent,LifeSpan BioSciences,antibodies-online,Rockland Immunochemicals,Inc.,OriGeneTechnologies,GeneTex,Raybiotech,Inc.,Acris Antibodies GmbH,Sino Biological,MyBioSource.com,Bioss Inc.,St.John’s Laboratory,Source BioScicne,Abcam,ProSci,Inc.,Clinic Sciences,Novus Biologicals,Creative Diagnostics,ThermoScientific Pierce Antibodies,PeproTech,MBL International,Miltenyi Biotec,GenWay Biotech,Inc.,LifeSpan Biosciences,Bioworld Technology,EXBIO Praha,a.s.,Novus Biologicals,BioVision,Bethyl Laboratories,Santa Crus BiotechnologyInc.,AbD Serotec,BioRad,BioLegend,Thermo Fisher Scientific,EMD Milipore,R&DSystems,Cell Sciences,Progen Biotechnik GmbH,Spring Bioscience,AtlasAntibodies,Abbiotec,Bostrebio,Nordic BioSite和其他知名的抗体制造商。可商购获得的FLT3抗体的非限制性实例包括来自BV10和4G8克隆的抗体及其生物学等效物或修饰版本，包括但不限于以下按供应商和目录编号列出的可商购获得的抗体：antibodies-onlineABIN487499,antibodies-online ABIN487500,LifeSpan Biosciences LS-C179623-100,LifeSpan Biosciences LS-C179624-50,Acris Antibodies AM20042AF-N,AcrisAntibodies AM20042FC-N,MBL International K0107-3,MBL International K0107-4,Novus Biologicals NBP1-54522-0.05mg,Novus Biologicals NBP1-54414,Santa CruzBiotechnology,Inc.sc-21788,Becton Dickinson Biosciences 564708,BectonDickinson Biosciences 563494。其他示例性市售抗体包括在Biocompare或市售抗体的其他数据库中列为对人FLT3具有反应性的所有抗体；非限制性实例包括本文公开的那些，按供应商和目录编号列出：Proteintech Group Inc.21049-1-AP,Proteintech GroupInc.15827-1-AP,Proteintech Group Inc.15826-1-AP,eBioscience 17-1357-41,eBioscience 12-1357-41,eBioscience 14-1357-80,eBioscience 17-1357-42,eBioscience 12-1357-42,eBioscience 14-1357-82,Abgent AP7644a,Abgent AP3068a,Aviva Systems Biology OAAB17159,Aviva Systems Biology OAAF00442,Aviva SystemsBiology ARP30009_T100,Aviva Systems Biology ARP30010_P050,Cell SignalingTechnology 3462S,Cell Signaling Technology3464S,Cell Signaling Technology3474S,Cell Signaling Technology 3466S,Cell Signaling Technology 3461S,CellSignaling Technology 3461L,Cell Signaling Technology 3463S,Cell SignalingTechnology 4577S,Fitzgerald Industries International 20R-2351,FitzgeraldIndustries International 70R-12259,Fitzgerald Industries International 70R-17325。用于PD-1和PD-L1的可商购的抗体是可获得的。参见例如biocompare.com/pfu/110447/soids/531283/Antibodies/PD1(描述了抗PD-1抗体的商业来源；上次访问时间为2019年7月3日)和biocompare.com/pfu/110447/soids/592604/Antibodies/PDL1(描述了抗PD-L1抗体的商业来源；上次访问时间为2019年7月3日)。本领域技术人员可以使用诸如RNA测序、DNA微阵列、实时PCR或染色质免疫沉淀(ChIP)等方法检测FLT3、PD-1和/或PD-L1的表达。可以使用流式细胞术、蛋白质印迹、2-D凝胶电泳、ELISA(酶联免疫吸附测定)或其他免疫测定等方法监测蛋白质的表达。

抗体等效物。本公开内容提供了以上公开的抗体的“等效物”或“生物学等效物”，其中抗体的抗原结合结构域与以上公开的任何抗体的抗原结合结构域至少80％、或85％、或90％、或95％、或至少97％相同使其称为上述公开的抗体的生物等效物。等效物的其他实例包括由在高严格条件下与编码以上公开的任何抗体的抗原结合域核酸序列的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；大约1x SSC至大约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xSSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。

抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。要被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将IgG CH3结构域结合至两个scF

本文公开的抗体组合物可以是在这些抗体中的任一个和另一个试剂(免疫结合物)之间形成的结合物的形式。在一个方面，本文公开的抗体被结合至放射性物质。在另一个方面，本文公开的抗体可以被结合至多种分子，例如聚乙二醇(PEG)。

抗体筛选。可以使用多种免疫测试来进行筛选，以鉴定具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测试的许多程序在本领域中是已知的。这些免疫测试通常涉及测量在FLT3、PD-1或PD-L1抗原、或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用采用对两个非干扰的FLT3、PD-1或PD-L1抗原表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测试，但是也可以采用竞争性结合测试(Maddox et al.(1983)J.Exp.Med.158:1211-1216)。

抗体纯化。可以将本文公开的抗体纯化至同质。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。

仅仅作为实施例，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用分离和纯化抗体。参见Strategies forProtein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,DanielR.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies:ALaboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。

色谱法的实施例包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液相色谱(例如HPLC或FPLC)进行色谱法。

在一方面，在亲和色谱中可以使用Protein A柱或Protein G柱。其他示例性的柱包括Protein A柱、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。

分离的核酸和制备CAR的方法

进一步的方面涉及一种分离的核酸，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成，该序列包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：FLT3抗体的抗原结合结构域组成；铰链结构域；跨膜结构域，例如CD28跨膜结构域；一个或多个共刺激区域，例如，选自CD28共刺激信号区域、4-1BB共刺激信号区域、ICOS共刺激信号区域和OX40共刺激区域；以及CD3ζ信号域。

不受理论的束缚，其他方面考虑了一种分离的核酸，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：外源分子(即非FLT3)的配体的结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域，例如CD28跨膜结构域；一个或多个共刺激区域，例如，选自CD28共刺激信号区域、4-1BB共刺激信号区域、ICOS共刺激信号区域和OX40共刺激区域；以及CD3ζ信号域。在进一步的此类方面，外源分子的配体的结合结构域识别并结合与该外源分子可操作地连接的FLT3抗体的抗原结合结构域；因此，生成FLT3 CAR。

在一些实施方案中，分离的核酸还包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，所述抗体或其抗原结合片段任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1。在其他实施方案中，提供了第二分离的核酸，其包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，所述抗体或其抗原结合片段任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1。在这些实施方案的任一个中，抗体或其抗原结合片段可以包含PD-1拮抗剂或激动剂和/或PD-L1拮抗剂或激动剂，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR区或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区和/或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合域的单链可变片段(scFv)和/或其等效物。在一些实施方案中，scFv包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

抗PD-1抗体的scFv多核苷酸序列：

CAGGTCCAATTGGTACAGAGCGGCGTCGAAGTAAAGAAGCCTGGAGCCAGCGTTAAAGTTTCTTGCAAGGCTTCAGGATATACTTTCACTAACTACTATATGTACTGGGTACGGCAGGCTCCAGGGCAAGGGTTGGAGTGGATGGGAGGGATCAATCCTTCTAACGGCGGCACTAACTTTAACGAAAAATTTAAAAATAGGGTGACCCTCACAACTGACTCAAGTACGACTACAGCATACATGGAACTCAAATCTCTCCAATTCGATGACACGGCTGTCTATTATTGCGCGAGAAGAGACTATCGCTTCGATATGGGGTTTGATTATTGGGGGCAAGGTACTACGGTTACCGTCAGCTCCGGGGGTGGCGGCTCCGGCGGCGGTGGGTCAGGTGGAGGAGGGTCTGACATTCAGATGACGCAATCCCCAAGCTCTCTGTCCGCGTCAGTGGGCGACCGAGTTACAATCACATGCCGCGCTTCTCAAGATGTGTCAACCGCTGTCGCCTGGTACCAACAGAAGCCTGGGAAGGCCCCTAAGCTTCTCATCTACTCAGCTTCTTTTCTGTACTCAGGGGTACCGTCTAGATTCTCAGGATCCGGTAGTGGGACGGACTTCACATTGACCATAAGTTCCTTGCAGCCTGAGGATTTCGCTACATATTATTGCCAACAGTACCTTTACCATCCTGCCACTTTTGGCCAGGGTACTAAGGTCGAGATCAAACGG，或其等效物。

抗PD-1抗体的scFv氨基酸序列：

Q V Q L V Q S G V E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T N Y Y M YW V R Q A P G Q G L E W M G G I N P S N G G T N F N E K F K N R V T L T T D SS T T T A Y M E L K S L Q F D D T A V Y Y C A R R D Y R F D M G F D Y W G Q GT T V T V S S G G G G S G G G G S G G G G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G DR V T I T C R A S Q D V S T A V A W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S F L Y SG V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L Y H PA T F G Q G T K V E I K R，或其等效物。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)，其包含PD-L1抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，scFv包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

抗PD-L1抗体的scFv多核苷酸序列：

GAAGTTCAGTTGGTCGAGTCAGGAGGAGGCCTGGTGCAACCCGGGGGCTCACTCCGGTTGTCCTGTGCTGCTTCAGGATTTACGTTTTCTGACTCATGGATACATTGGGTGCGCCAAGCCCCGGGCAAGGGGCTGGAATGGGTGGCCTGGATCTCTCCGTATGGGGGTTCCACCTACTATGCTGATTCAGTAAAAGGACGGTTCACTATAAGCGCGGATACAAGTAAGAATACTGCCTATCTTCAAATGAATTCTCTTCGCGCCGAGGATACAGCGGTATATTATTGCGCTAGACGACATTGGCCAGGGGGCTTTGACTATTGGGGGCAGGGTACTCTTGTGACCGTTAGTGCGGGAGGTGGTGGCAGCGGTGGAGGCGGCTCCGGGGGTGGTGGTTCAGAAATTGTCCTGACTCAATCCCCTGCCACATTGAGTTTGAGCCCAGGAGAGAGAGCAACTCTGTCATGCCGGGCGTCAAAAGGTGTCAGTACGTCAGGCTACTCCTATCTTCATTGGTATCAGCAGAAACCGGGAGAAGCGCCGCGCCTTCTCATATACCTGGCTAGTTACCTTGAGAGTGGCGTCCCGGCCCGGTTTAGTGGGAGTGGGTCTGGGACTGATTTTACGCTGACAATCAGCAGTCTTGAGCCAGAGGACTTCGCGGTTTACTATTGCCAACATTCACGCGATTTGCCCCTCACCTTCGGCGGTGGAACGAAGGTTGAAATAAAA，或其等效物。

抗PD-L1抗体的scFv氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGEAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK，或其等效物。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体或其每个的等效物的相关CDR区，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR或其每个的等效物。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区和/或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合域的单链可变片段(scFv)和/或其等效物。

本文提供了分离的核酸或载体，其包含分离的核酸或载体，其包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)细胞内结构域；以及编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，所述抗体或其抗原结合片段包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。

上文公开的编码CAR的分离的核酸或载体可以包含本文公开的任何CAR，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，编码CAR的本公开的分离的核酸或载体进一步包含信号传导结构域，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，编码CAR的分离的核酸或载体可以进一步包含可诱导的或组成型活性元件，或基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方案中，可诱导的或组成型活性元件控制编码免疫调节分子或细胞因子的多核苷酸的表达。免疫调节分子或细胞因子可以包含以下中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM-CSF、IL-12、IL-2、低毒性IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、LEC和/或OX40L。在另一方面，免疫调节分子或细胞因子可以包含以下因子，或基本上由其组成，或由其组成：IL-12和/或GM-CSF；和/或IL-12和/或IL-2和低毒性IL-2中的一种或多种；和/或IL-12和/或IL-15；和/或IL-12和/或IL-21；IL-12和/或B7.1；和/或IL-12和/或OX40L；和/或IL-12和/或CD40L；和/或IL-12和/或GITRL；和/或IL-12和/或IL-18；和/或IL-2和低毒性IL-2中的一种或多种以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或IL-15和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或IL-21以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或GM-CSF以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或OX40L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或CD137L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或包含B7.1和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或CD40L和CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种；和/或GITRL以及CCL19、CCL21和LEC中的一种或多种。

在一个实施方案中，编码CAR的分离的核酸或载体的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，编码CAR的分离的核酸或载体的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，或基本上由其组成，或由其组成。在一个单独的方面，编码CAR的分离的核酸或载体的共刺激信号传导区域包含CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域，或基本上由其组成，或由其组成。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸可以包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)CD8α铰链结构域；(c)CD8α跨膜结构域；以及(d)CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域。在其他实施方案中，编码CAR的多核苷酸包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：(a)FLT3抗体的抗原结合结构域；(b)CD8α铰链结构域；(c)CD8α跨膜结构域；(d)CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及(e)CD3ζ信号传导结构域。

对于以上公开的任何分离的核酸或载体，编码CAR的分离的核酸或载体的FLT3抗体的抗原结合结构域可以包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：重链可变区，其包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：

CDHR1，其具有氨基酸序列(SYWMH)或(NYGLH)或其每一个的等效物，

CDHR2，其具有氨基酸序列(EIDPSDSYKDYNQKFKD)或(VIWSGGSTDYNAAFIS)或其每一个的等效物，以及

CDHR3，其具有氨基酸序列(AITTTPFDF)或(GGIYYANHYYAMDY)或其每一个的等效物；和/或轻链可变区，其包含：

CDLR1，其具有氨基酸序列(RASQSISNNLH)或(KSSQSLLNSGNQKNYM)或其每一个的等效物，

CDLR2，其具有氨基酸序列(YASQSIS)或(GASTRES)或其每一个的等效物，以及

CDLR3，其具有氨基酸序列(QQSNTWPYT)或(QNDHSYPLT)或其每一个的等效物。

对于以上公开的任何分离的核酸或载体，分离的核酸或载体的编码识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域可以包含PD-1拮抗剂或激动剂和/或PD-L1拮抗剂或激动剂和/或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域或其抗原结合片段包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的CDR区或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1和/或PD-1的抗体的重链和轻链可变区和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗体或其抗原结合片段包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域或基本上由其组成或由其组成的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合结构域或基本上由其组成或由其组成的单链可变片段(scFv)，和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。

在一个实施方案中，识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗体是双特异性抗体。在另一个实施方案中，双特异性抗体包含PD-1拮抗剂和PD-L1拮抗剂，或基本上由其组成，或由其组成，并任选地进一步包括接头，或基本上由其组成，或由其组成。在另一个实施方案中，双特异性抗体包含PD-1和PD-L1抗体的CDR区，或基本上由其组成，或由其组成，并可以任选地进一步包括接头，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，双特异性抗体包含针对PD-1和PD-1的抗体的重链和轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成，并可以任选地进一步包括接头，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，双特异性抗体包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域或基本上由其组成或由其组成的单链可变片段(scFv)和含有PD-L1抗体的抗原结合结构域或基本上由其组成或由其组成的单链可变片段(scFv)，和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成，并可以任选地进一步包括接头，或基本上由其组成，或由其组成。

在一个特定的实施方案中，单链可变片段(scFv)包含PD-L1抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成，其包括以下多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成：

在一方面，本文所述的载体是质粒。在另一方面，所述载体是选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体的病毒载体。在另一方面，所述载体是双顺反子的。

本公开内容的分离的核酸或载体可以进一步包含启动子和/或增强子，或基本上由其组成，或由其组成，所述启动子和/或增强子可操作地连接至编码识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗体或抗原结合片段的多核苷酸。在一些实施方案中，与识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗体或抗原结合片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和/或增强子是高表达启动子。高表达启动子的非限制性实例是巨细胞病毒(CMV)、骨髓增生性肉瘤病毒增强子(MND)和EF1α启动子。

在某些实施方案中，公开了产生表达FLT3 CAR的细胞的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：用编码FLT3 CAR的核酸序列和编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列转导分离的细胞群，任选地，所述抗体是双特异性抗体，其任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1或其每个的等效物。在一方面，产生CAR表达细胞的方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或由以下步骤组成：用本发明的分离的核酸或载体转导分离的细胞。分离的细胞可以选自T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、髓样细胞、单核细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，这是通过以下方式实现的：(i)使用编码FLT3 CAR构建体及其抗体或其抗原结合片段的载体或(ii)使用两种载体，一种编码FLT3 CAR，另一种编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，这是通过以下方式实现：使用编码FLT3CAR构建体和/或其抗体或其抗原结合片段的mRNA，所述mRNA又可以通过电穿孔引入细胞中。参见例如Choi et al.(2010)Biomed Microdevices 12(5):855-863。在另一方面，选择已经成功地用所述核酸序列转导的细胞的亚群。在一些实施方案中，分离的细胞是T细胞、动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞，从而产生FLT3 CAR T细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞，从而产生FLT3 CAR NK细胞。在一些实施方案中，分离的细胞是B细胞，动物B细胞、哺乳动物B细胞、猫B细胞、犬B细胞或人B细胞，从而产生FLT3 CAR B细胞。

不受理论的束缚，其他方面考虑了用分离的核酸转导细胞的方法，所述分离的核酸包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成，该序列包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：外源分子(即非FLT3)的配体的结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域，例如CD28跨膜结构域；一个或多个共刺激区域，例如，选自CD28共刺激信号区域、4-1BB共刺激信号区域、ICOS共刺激信号区域和OX40共刺激区域；以及CD3ζ信号域，即“通用CAR细胞”。在进一步的这些方面中，识别的外源分子的配体的结合结构域和与可操作地连接的FLT3抗体的抗原结合结构域可操作地连接的外源分子；因此，在引入与外源分子可操作地连接的FLT3抗体的抗原结合结构域时，就产生了FLT3 CAR。在一些实施方案中，外源分子是生物素或抗生蛋白链菌素。

在一些实施方案中，可以进一步修饰表达所公开的CAR的T细胞，以减少或消除内源TCR的表达。减少或消除内源性TCR可以减少脱靶效应并提高T细胞的有效性。可以使用多种方法来产生稳定地缺乏功能性TCR表达的T细胞。T细胞以复合物的形式内在化、分选和降解整个T细胞受体，在静止T细胞中的半衰期约为10小时，在受激T细胞中的半衰期为3小时(von Essen,M.et al.(2004)J.Immunol.173:384-393)。TCR复合物的正确功能需要组成TCR复合物的蛋白质的化学计量比正确。TCR功能还需要两个具有ITAM基序的功能正常的TCRζ蛋白。MCR肽配体结合后，TCR的激活需要在同一T细胞上结合多个TCR，所有都必须正确发出信号。因此，如果TCR复合物被无法正确结合或无法最佳信号传递的蛋白质所破坏，则T细胞将无法充分激活以开始细胞反应。

因此，在一些实施方案中，可使用RNA干扰(例如shRNA、siRNA、miRNA等)、CRISPR或靶向原代T细胞中编码特定TCR(例如TCR-α和TCR-β)和/或CD3链的核酸的其他方法消除TCR表达。通过阻断一种或多种这些蛋白的表达，T细胞将不再产生TCR复合物的一种或多种关键成分，从而使TCR复合物不稳定并阻止功能性TCR的细胞表面表达。即使如此，但当使用RNA干扰时某些TCR复合物可以回收到细胞表面，RNA(例如shRNA、siRNA、miRNA等)也会阻止TCR蛋白的新产生，从而导致整个TCR复合物的降解和去除，导致产生功能性TCR表达稳定缺乏的T细胞。

抑制性RNA(例如shRNA、siRNA、miRNA等)在原代T细胞中的表达可以使用任何常规的表达系统(例如慢病毒表达系统)来实现。尽管慢病毒可用于靶向静止的原代T细胞，但并非所有T细胞都会表达shRNA。这些T细胞中的某些可能无法表达足够数量的RNA，从而无法充分抑制TCR表达，从而改变T细胞的功能活性。因此，可以例如通过细胞分选或分离技术去除在病毒转导后保留中等至高TCR表达的T细胞，从而使剩余的T细胞缺乏细胞表面TCR或CD3，从而使功能性TCR或CD3表达不足的T细胞的分离的群体得以扩增。

CRISPR在原代T细胞中的表达可以使用常规CRISPR/Cas系统实现，并指导对靶标TCR特异的RNA。合适的表达系统(例如慢病毒或腺病毒表达系统)是本领域已知的。类似于抑制剂RNA的递送，CRISPR系统可以被用于特异性靶向静止的原代T细胞或其他合适的免疫细胞进行CAR细胞治疗。此外，就CRISPR编辑不成功的程度而言，可以根据上述方法选择成功的细胞。例如，如上所述，可以例如通过细胞分选或分离技术去除在病毒转导后保留中等至高TCR表达的T细胞，从而使剩余的T细胞缺乏细胞表面TCR或CD3，从而使分离的缺乏功能性TCR或CD3表达的T细胞群体得以扩增。进一步认识到，CRISPR编辑构建体可以被用于敲除内源TCR和敲入本文公开的CAR构建体。因此，可以理解的是，CRISPR系统可以被设计用于实现这些目的中的一个或两者。

分离的细胞的来源。在扩增和遗传修饰本文公开的细胞之前，细胞可以从对象(例如在涉及自体疗法的实施方案中)或可商购的培养物(例如美国典型培养物保藏中心(ATCC))中获得。

细胞可以从对象中的许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下实施例中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies

替代性地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对T细胞，BCL2(AAA)Jurkat(

载体。可以使用包含如上所述的多核苷酸的载体来制备CAR细胞。因此，本公开提供：(i)载体，任选地是双顺反子载体，其包含编码FLT3 CAR或其互补序列或等效物的核酸序列的多核苷酸序列，并且任选地，还包含编码任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1或其每个的等效物的抗体或其抗原结合片段的核酸序列的多核苷酸序列，或(ii)包含编码FLT3CAR或其互补序列或等效物的核酸序列的多核苷酸序列的载体，以及包含编码任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1或其每个的等效物的抗体或其抗原结合片段的核酸序列的多核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含PD-1拮抗剂或激动剂和/或PD-L1拮抗剂或激动剂或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR区或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)，和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，该单链可变片段包含PD-1抗体的抗原结合结构域，其包含由以下序列编码的氨基酸序列：

抗-PD-1scFv:

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含单链可变片段(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，该单链可变片段源自针对PD-L1的抗体，其包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成：

抗-PD-L1 scFv:

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体包含PD-1拮抗剂或激动剂和/或PD-L1拮抗剂或激动剂，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含识别并结合PD-1的抗体和/或抗PD-L1的抗体的相关CDR区或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区和/或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-1抗体的抗原结合域的单链可变片段(scFv)和/或其每个等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)或基本上由其组成，或由其组成，其以上提供的抗PD-1scFv氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对PD-L1的抗体的单链可变片段(scFv)，或基本上由其组成，或由其组成，其包含上文提供的抗PD-L1 scFv氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。

在任何上述实施方案中，载体可以任选地包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或由以下序列组成：可检测的标记和/或赋予抗生素抗性的多核苷酸和/或用于CAR和识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合域的转录和翻译的调节元件。

在以上任何实施方案中，每个多核苷酸可以可操作地连接至调节性多核苷酸，任选地为启动子和/或增强子。在一些实施方案中，编码包含识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可操作地连接至启动子和/或增强子，该启动子和/或增强子允许抗体或其抗原结合片段的过表达。

在一些实施方案中，FLT3 CAR的分离的核酸序列编码包含以下序列或基本上由以下序列组成或由以下序列组成的CAR：FLT3抗体的抗原结合结构域；铰链结构域；CD28跨膜结构；一个或多个共刺激区域，其选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传导区域和OX40共刺激区域；以及CD3ζ信号传导结构域。在一方面，抗原结合结构域对FLT3的结合亲和力比对与FLT3无关的分子的结合亲和力大至少约10

在某些实施方案中，分离的核酸序列进一步包含多核苷酸启动子序列，或基本上由其组成，或由其组成，该多核苷酸启动子序列位于编码FLT3抗体的FLT3抗原结合结构域的抗原结合结构域的多核苷酸的上游。在一些实施方案中，该启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子序列、骨髓增生性肉瘤病毒增强子(MND)启动子、或EF1α启动子。本文提供了所述启动子的非限制性示例性序列。

CMV启动子序列：

TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG，以及任选的其等效物。

CMV启动子序列：

GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATC，以及任选的其等效物。

MND启动子序列：

AACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTAGAGGATC，以及任选的其等效物。

EF1α启动子序列：

AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC，以及任选的其等效物。

在某些实施方案中，分离的核酸序列进一步包含编码可诱导的胱天蛋白酶(“iCasp”)或其他“自杀基因”的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，该多核苷酸序列位于编码FLT3抗体的FLT3抗原结合结构域的抗原结合结构域的多核苷酸的上游；本文提供了所述iCasp基因的非限制性示例性多核苷酸序列：iCasp序列：

ATGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATA，以及任选的其等效物。

在一些实施方案中，iCasp基因构建体包含可操作地连接至FKBP蛋白结构域的Caspase 9的一部分。由CASP9基因(GenBank登录号NM001229)编码的Caspase 9是启动子胱天蛋白酶的非限制性实例，并在线粒体凋亡途径中起作用。其一部分以上面公开的非限制性示例性序列存在。优化以上公开的非限制性示例性序列中的FKBP蛋白结构域以结合诱导剂，特别是二聚化的化学诱导剂(CID)。在上述公开的序列中，化学诱导剂是AP1903，这是一种已在健康志愿者中证明是安全的合成药物。可以设想，可以使用FKBP结构域和二聚化的化学诱导剂两者的等效物(例如，AP1903或FKBP的修饰形式)代替所列的示例性实施方案。在某些方面，二聚化可由已知促进Caspase 9二聚化的任何小分子诱导。对该小分子的施用导致Caspase 9的交联和活化，这继而诱导表达iCasp基因的细胞的凋亡。

iCasp氨基酸序列：

MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIY，以及任选的其等效物。

在某些实施方案中，分离的核酸序列进一步包含编码2A肽(T2A)的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，该多核苷酸序列位于编码FLT3抗体的FLT3抗原结合结构域的抗原结合结构域的多核苷酸的上游；本文提供了编码所述T2A多核苷酸的非限制性示例性序列：

T2A序列：

GCCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGC CCT，以及任选的其等效物。

T2A氨基酸序列：

AEGRGSLLTCGDVEENPGP，以及任选的其等效物。

在涉及T2A的实施方案中，T2A介导的“自我切割”可导致两种分离的蛋白质的比例为1:1。

在某些实施方案中，分离的核酸序列进一步包含编码信号肽的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成，该多核苷酸序列位于编码FLT3抗体的FLT3抗原结合域的抗原结合域的多核苷酸的上游；本文提供了编码所述信号肽的非限制性示例性序列的多核苷酸。

编码信号肽序列的多核苷酸序列：

ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC，

以及任选的其等效物。

信号肽氨基酸序列：

MGWSSIILFLVATATGVH，以及任选的其等效物。

信号肽序列：

MGWSCIILFLVATATGVHS，以及任选的其等效物。

信号肽序列：

MDWIWRILFLVGAATGAHS，以及任选的其等效物。

在一些实施方案中，分离的核酸包含可检测的标记和/或赋予抗生素抗性的多核苷酸。在一方面，标记或多核苷酸可用于选择用分离的核酸成功转导的细胞。在某些实施方案中，该可检测标记是衍生自c-myc基因的蛋白质标签，称为“myc标签”。下面公开了编码所述myc标签的非限制性示例性序列。

“myc”序列：

GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG，以及任选的其等效物。

“myc”氨基酸序列：

EQKLISEEDL，以及任选的其等效物。

在一些实施方案中，分离的核酸序列包含在载体内。在某些实施方案中，载体是质粒。在其他实施方案中，载体是病毒载体。这样的非限制性实例包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在特定的实施方案中，载体是慢病毒载体。

在以下实施例中详细地讨论了示例性的载体的制备和使用所述载体来生产表达CAR的细胞。总的来说，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体加入表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。可以使用类似的方法来构建包含编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸序列。所述载体可以适于复制和整合到真核生物中。用于生产包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)。

在一方面，术语“载体”是指保留了感染和转导非分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力的重组载体。在一些方面，载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面，载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的实施例包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。替代性地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒(MLV)。很明显，根据本公开的病毒载体不必被局限于特定病毒的组分。病毒载体可以包含衍生自两种或更多种不同病毒的组分，并且还可以包括合成的组分。载体组分可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。

本公开的重组载体可以衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的实施例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群组包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(VMV)、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123、7,056,699、7,07,993、7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。

美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进向靶细胞基因组的整合。该专利教导了每个逆转录病毒包含被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复(LTR)的区域而被处于两个末端的侧翼。LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA的3'末端独特的序列。R衍生自在RNA的两个末端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，多聚(A)加成(终止)的位点是在LRT右边的R和U5之间的边界处。U3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应于细胞的(在某些情况下为病毒的)转录激活蛋白。

关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，其包括DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶(IN)，它们介导基因组的复制。

对于病毒载体颗粒的生产，载体RNA基因组被在宿主细胞中由编码它的DNA构建体表达。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个)，以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒组分。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组，或者它们可以以混合物的方式被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。

用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：Invitrogen的pLenti系列版本4、6和6.2“ViraPower”系统，由Lentigen Corp.制造；pHIV-7-GFP，由City of HopeResearch Institute实验室生成和使用；“Lenti-X”慢病毒载体，pLVX，由Clontech制造；pLKO.1-puro，由Sigma-Aldrich制造；pLemiR，由Open Biosystems制造；以及pLV，由Virology(CBF),Berlin,Germany的CharitéMedical School,Institute实验室生成和使用。

将外源核酸引入本领域的其他方法是已知的，包括但不限于使用RNA电穿孔、纳米技术、睡眠美容载体、逆转录病毒和/或腺病毒中的一种或多种进行基因递送。此外，不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白免疫印迹)或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。

包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将CAR包装进逆慢病毒或转录病毒包装系统。包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体含有促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包含至少一种逆转录病毒辅助DNA序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5′LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′LTR，但是编码外来的聚腺苷酸化位点(例如SV40聚腺苷酸化位点)、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、或长臂猿白血病病毒(GALV)。外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒(HCMV)即早期(IE)增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)的增强子和启动子(U3区域)、Rous肉瘤病毒(RSV)的U3区域、脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)启动子的HCMV IE增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性MMLV或GALV的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的(貂病灶形成)或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒(GALV)env蛋白、人类免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白、人类T细胞白血病(HTLV)I型和II型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。

在包装过程中，包装质粒和表达DCLK1的逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞(ATCC No.CRL1573,ATCC,Rockville,Md.)，从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本公开的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞)共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本公开的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞或造血干细胞)一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。

在另一方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞(例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞)的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代性地，载体可以被引入游离地(episomally)维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。

在一个具体的实施方案中，本文提供了一种分离的多核苷酸或载体，其包含图1所示的元件以及每个公开元件的等效物。图1公开了具有分泌性PD-1-PD-L1双特异性抗体的双顺反子FLT3 CAR。FLT3 CAR由EF1α启动子驱动。PD-1-PD-L1 biAb通过T2A与CAR连接，并由分泌信号肽(SS)引导。可将分离的多核苷酸插入侧翼有长末端重复序列的载体(例如慢病毒载体)中。

FLT3特异的CAR细胞

本公开的方面涉及一种分离的细胞，其包含如本文所述的分离的多核苷酸和/或载体，其中所述细胞已经表达了所述多核苷酸。在一方面，通过在还表达或包含PD-1和/或PD-L1特异性抗原结合区的宿主细胞中表达本文公开的分离的多核苷酸来制备FLT3 CAR。该细胞是原核或真核细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞。真核细胞可以来自任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞，例如人、猫或犬细胞。在其他实施方案中，真核细胞是免疫细胞，任选地是T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、髓样细胞、单核细胞或巨噬细胞。该细胞在治疗和诊断上是有用的。在一方面，本公开的分离的细胞表达CAR并分泌抗体，任选地是双特异性抗体。

在具体的实施方案中，分离的细胞包含外源CAR，或基本上由其组成，或由其组成，所述外源CAR包含以下序列，或基本上由其组成，或由其组成：FLT3抗体的抗原结合结构域；铰链结构域；跨膜结构域，例如CD28跨膜结构域；以及任选的一个或多个共刺激区域，例如选自CD28共刺激信号区域、4-1BB共刺激信号区域、ICOS共刺激信号区域和OX40共刺激区域；以及CD3ζ信号传导域以及识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合域。在另一方面，如下所述已经激活了细胞。

本文进一步提供了本公开的分离的细胞群。还提供了从上述细胞活化和扩增的细胞群。群体可以是基本上均质的，具有至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％相同的细胞。

CAR细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的CAR的细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来激活和扩增细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，以及例如Lapateva et al.(2014)Crit Rev Oncog 19(1-2):121-132；Tam et al.(2003)Cytotherapy 5(3):259-272；Garcia-Marquez et al.(2014)Cytotherapy16(11):1537-1544的参考文献中描述的方法。使用FLT3、PD-1或PD-L1抗原离体刺激能够激活并扩增表达所选的CAR的细胞亚群体。替代性地，可以通过与FLT3、PD-1或PD-L1抗原相互作用而在体内激活细胞。

在某些免疫细胞的情况下，可能需要另外的细胞群、可溶性配体和/或细胞因子或刺激剂来活化和扩增细胞。相关试剂是本领域公知的，并且根据已知的免疫学原理进行选择。例如，可溶性CD-40配体可能有助于激活和扩展某些B细胞群体。类似地，辐照的饲养细胞可用于激活和扩增NK细胞的程序中。

激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下实施例中描述了示例性的方法。用于与本公开相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies

本文进一步描述了分离的复合物，其包含与表达FLT3和/或PD-1和/或PD-L1和/或其片段的细胞结合的本发明的分离的细胞，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，分离的复合物包含结合至FLT3和/或PD-1和/或PD-L1和/或其片段的本发明的分离的细胞，或基本上由其组成，或由其组成。

组合物和载体

本公开内容的其他方面涉及组合物，其包含载体或以下产品中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成：例如，FLT3 CAR，包含FLT3 CAR和PD-1和/或PD-L1抗原结合区的分离的细胞，细胞群，分离的核酸，载体，含有编码FLT3 CAR的多核苷酸及其抗体或其抗原结合片段(任选地双特异性抗体)的分离的细胞。载体可以是药学上可接受的载体。在一个方面，本文提供了一种组合物，其包含以下组分，或基本上由其组成，或由其组成：在本文中公开的分离的核酸或载体，抗体，抗原结合片段，多肽，分离的细胞和/或细胞群，以及任选地药学上可接受的载体。

在其他方面，该组合物可以另外包含免疫调节分子和/或分离的核酸，其包含编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，所述抗体或其抗原结合片段任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR区或其每一个的等效物和/或所述抗体或其抗原结合片段，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR区或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合域的单链可变片段(scFv)和/或其每一个的等效物。在一些实施方案中，scFv包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

抗-PD-1scFv：

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含衍生自针对PD-L1的抗体的单链可变片段(scFv)，其包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

抗-PD-L1 scFv：

在一些实施方案中，组合物包含FLT3抑制剂。不受理论的束缚，相信此类FLT3抑制剂可增加细胞上表面FLT3的表达。FLT3抑制剂的非限制性例子包括gilteritinib(Astellas)、奎扎替尼(Ambit Biosciences)、米哚妥林(Novartis)、sorafenib(Bayer andOnxy Pharmaceuticals)、舒尼替尼(Pfizer)、lestarutinib(Cephalon)、FF-10101(Fuijfilm)以及多韦替尼(Novartis或Oncology Venture)。

简单来说，本公开的药物组合物，包括但不限于如本文所述的任何要求保护的组合物，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用。在某些实施方案中，本公开的组合物被配制用于静脉内施用。

在整个治疗过程中，细胞或组合物的施用可以以一个剂量连续或间歇地进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗的目的以及所治疗的对象而变化。单次或多次施用可以根据治疗医师选择的剂量水平和方式进行。合适的剂型和施用药剂的方法是本领域已知的。在另一方面，本公开的细胞和组合物可以与其他治疗组合施用。

使用本领域已知的方法和例如在PCT/US2011/064191中描述的方法将细胞和细胞群体施用于宿主。可以进行本公开的细胞或组合物的这种施用来产生用于实验和筛选测定的具有所需疾病、病症或病状的动物模型。

使用方法

治疗应用。本公开的方法方面涉及用于在有此需要的对象中抑制肿瘤/癌症和/或用于治疗有此需要的癌症患者或对象的方法。本文提供了在对象中抑制表达FLT3的癌症或肿瘤(任选地急性髓细胞性白血病(AML))的生长的方法，该方法包括以下步骤，或基本上由其组成，或由其组成：使癌症或肿瘤与本发明的分离的细胞或组合物接触。在一方面，抑制对象中表达FLT3的癌症或肿瘤(任选地急性髓细胞性白血病(AML))的生长的方法，包括以下步骤，或基本上由其组成，或由其组成：测量对象中PD-1和/或PD-L1的表达，并向表达PD-1和/或PD-L1的对象施用本发明的分离的细胞、抗体、抗原结合片段和/或组合物。本文进一步公开了抑制对象中的癌症或肿瘤(任选地是急性髓细胞性白血病(AML))的生长的方法，其包括以下步骤，或基本上由其组成，或由其组成：测量对象中PD-1和/或PD-L1的表达，并向表达PD-1和/或PD-L1的对象施用抗体、抗原结合片段和/或组合物。接触可以是体外或体内的。在一些实施方案中，当接触是体内的时，分离的细胞对于所治疗的对象是自体同源的。在其他实施方案中，当接触是体内的时，分离的细胞对于所治疗的对象是同种异体的。在一些实施方案中，所述癌症是影响血液和/或骨髓的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是急性髓细胞性白血病。在一些实施方案中，肿瘤/癌细胞表达或过表达FLT3和任选的PD-1。在某些实施方案中，这些方法包括向对象或患者施用有效量的本文公开的分离的细胞或组合物，或基本上由其组成，或由其组成。在进一步的实施方案中，该分离的细胞包含或表达CAR和/或任选地识别并结合PD-1和/或PD-L1的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR区或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区和/或其每一个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体抗体的抗原结合域的单链可变片段(scFv)和/或其每一个的等效物。在一些实施方案中，scFv包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

抗-PD-1scFv:

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含衍生自针对PD-L1的抗体的单链可变片段(scFv)，其包含由以下多核苷酸序列编码的氨基酸序列：

抗-PD-L1 scFv：

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体或其每个的等效物的相关CDR区，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1的抗体和/或针对PD-L1的抗体的相关CDR或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对PD-1和/或PD-L1的抗体的重链和/或轻链可变区和/或其每个的等效物，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含含有PD-1抗体的抗原结合结构域的单链可变片段(scFv)和/或含有PD-L1抗体的抗原结合域的单链可变片段(scFv)和/或其每个的等效物。

在其他实施方式中，分离的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，分离的细胞对于所治疗的对象或患者是自体同源的或同种异体的。在另一方面，所述肿瘤/癌症表达FLT3，并且已经通过诊断方法(例如本文所述的方法)选择了所述对象用于治疗。所述对象是动物，哺乳动物、犬、猫、牛、马、鼠或人类患者。

本文公开的FLT3 CAR细胞可以单独施用，也可以与本文公开的抗体或其抗原结合片段(任选的双特异性抗体)、稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或与其他成分(例如细胞因子或其他具有免疫调节作用的细胞群)组合施用。它们可以作为一线治疗、二线治疗、三线治疗或进一步治疗进行给药。其他疗法的非限制性实例包括细胞减少疗法，例如外科手术、放射疗法、冷冻疗法、或化学疗法、或生物制剂，例如造血干细胞移植。因此，在一些实施方案中，本文公开的抑制癌症或肿瘤的生长的方法可进一步包括向对象施用有效量的细胞减少疗法，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，细胞减少疗法包括化学疗法、冷冻疗法、热疗、靶向疗法和/或放射疗法，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，可以在这些非限制性示例性疗法中的任何一种之前或之后，例如在造血干细胞移植之前或在放射疗法或化学疗法之后，施用FLT3 CAR细胞。在造血干细胞移植之前使用FLT3 CAR细胞的实施方案中，可以在递送造血干细胞之前使用FLT3 CAR细胞以实现缓解。一般而言，造血干细胞移植在缓解后更为成功。其他非限制性实例包括其他相关的细胞类型，例如未修饰的免疫细胞、包含表达一种或多种免疫调节分子的载体的修饰的免疫细胞、或对不同于本文公开的抗原的抗原具有特异性的CAR细胞。与本公开的CAR细胞一样，在一些实施方案中，这些细胞可以是自体同源的或同种异体的。适当的治疗方案将由主治医师或兽医确定。

可以通过首先识别要接受治疗的患者来对方法进行个性化。在一方面，对象或患者是动物、哺乳动物、犬、猫、牛、马、鼠或人类患者。在这方面，从患者中分离出癌细胞或肿瘤细胞的样品，以确定该细胞是否表达FLT3和/或PD-1和/或PD-L1。如果确定细胞表达这些标记物中的一种或多种，则选择患者接受治疗并进行治疗。确定标记物表达的方法是本领域已知的。本文描述了一些这样的方法。

在一些实施方案中，将FLT3 CAR细胞与FLT3抑制剂一起施用。不受理论的束缚，相信此类FLT3抑制剂可增加细胞上表面FLT3的表达。FLT3抑制剂的非限制性例子包括gilteritinib(Astellas)、奎扎替尼(Ambit Biosciences)、米哚妥林(Novartis)、sorafenib(Bayer and Onxy Pharmaceuticals)、舒尼替尼(Pfizer)、lestarutinib(Cephalon)、FF-10101(Fuijfilm)以及多韦替尼(Novartis或Oncology Venture)。

在某些实施方案中，患者或对象在接受(即被施用)有效量的分离的细胞后维持或恢复正常的造血作用。正常的造血作用是某些癌症的关键终点，例如但不限于影响血液或骨髓的癌症，例如淋巴瘤或白血病，例如但不限于急性髓细胞性白血病或急性淋巴细胞性白血病。治疗后确定“正常造血”的方法在本领域中是已知的，包括但不限于将基线血细胞计数与治疗后血细胞计数进行比较的“针刺(pin prick)”血液测试和/或循环CD34+细胞的类似比较。其他非限制性示例性方法包括骨髓活检以证实植入。无法维持或恢复正常的造血功能(也称为正常植入)与反复需要输血和/或需要抗生素和/或高发病率和高死亡率相关，此外还与症状指标相关，例如但不限于贫血、面色苍白、体位性低血压以及由于缺乏血小板恢复而引起的出血和/或淤青。正常的造血和/或植入可通过临床可接受的阈值来定义，例如但不限于持续性粒细胞计数>1.0x10

本公开的药物组合物可以以适合于待治疗或预防的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是给药的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。在一方面，它们通过直接注射或全身性(例如静脉内注射或输注)直接给药。

CAR表达细胞的总剂量可以取决于例如上述公开的因素而变化。在一些实施方案中，剂量可以在1至10

自杀基因。在涉及自杀基因作为编码CAR的分离的核酸序列的一部分的实施方案中，自杀基因可以用于在治疗结束时终止表达CAR的细胞。在涉及包含自杀基因的CAR表达细胞的方法方面，可以通过在不再需要FLT3特异性CAR细胞应答的点处引入诱导剂分子来诱导自杀基因。自杀基因的诱导导致CAR细胞的凋亡。因此，可以预期，使用包含可诱导的自杀基因的CAR构建体，可以通过诱导细胞凋亡去除表达CAR的细胞，从而提高CAR细胞应用的安全性。在使用诱导剂的实施方案中，例如但不限于小分子，用于诱导自杀基因表达的诱导剂的剂量范围可以为0.001至10.0mg/kg体重，或者0.01至1.0mg/kg，以及其间的范围。

诊断应用。本公开的各方面提供了用于确定患者是可能还是不太可能对FLT3CAR疗法作出反应的示例性方法。在特定的实施方案中，该方法包括将从患者体内分离的生物样品与有效量的抗FLT3和/或PD-L1和/或PLD1抗体接触，并检测与癌症/肿瘤样品结合的任何抗体的存在。在一些实施方案中，肿瘤样品是任何生物样品，包括癌症/肿瘤细胞(例如肿瘤活检)、循环的癌症/肿瘤细胞、和/或可能包含所述细胞的任何其他体液或组织。在进一步的实施方案中，与癌症/肿瘤样品结合的一种或多种抗体的存在指示患者可能对FLT3CAR疗法有反应，而与肿瘤样品结合的抗体的不存在则表明患者不太可能对FLT3 CAR疗法产生反应。在一些实施方案中，该抗体可以结合从患者获得的0％至100％的癌症/肿瘤样品，所述样品可以包含FLT3阳性的细胞。在这样的实施方案中，应当理解，FLT3和/或PD-1和/或PD-L1阳性肿瘤细胞的百分比越高，FLT3 CAR疗法将有效的可能性越高。在一些实施方案中，癌症/肿瘤样品包含白血病胚细胞。在另外的实施方案中，检测到表达FLT3的白血病胚细胞的更多或约90％和/或检测到PD-1和/或PD-L1的至少50％指示患者具有用于FLT3CAR疗法的有利的“治疗窗”。在一些实施方案中，该方法涉及使用与肿瘤或癌症相关的诊断测定、标志物或基因表达谱。一个非限制性的例子是使用流式细胞仪或另一种细胞分选方法对表达CD45

试剂盒

如本文所述，本公开提供了产生和施用FLT3 CAR细胞及包含识别和结合PD-1和/或PD-L1的抗原结合结构域的抗体或其抗原结合片段的方法。在一个特定方面，本公开提供了用于执行这些方法的试剂盒以及用于执行本公开的方法的说明书，例如收集细胞和/或组织、和/或进行筛选/转导等、和/或分析结果。

在一方面，试剂盒包含本文公开的任何一种分离的核酸和/或包含所述核酸和/或分离的同种异体细胞的一种或多种载体，优选T细胞或NK细胞，和/或有关从患者获得自体细胞的说明，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，本文公开了试剂盒，其包含本文公开的组合物和任选的使用说明书，或基本上由其组成，或由其组成。这样的试剂盒还可以包含适合于FLT3 CAR表达细胞的转导和/或选择和/或活化和/或扩增的培养基和其他试剂，例如本文公开的那些，或基本上由其组成，或由其组成。

在一方面，试剂盒包含分离的表达CAR的细胞或其群体，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，该试剂盒的细胞在施用于需要其的对象之前可能需要激活和/或扩增。在进一步的实施方案中，试剂盒可以进一步包含培养基和试剂(例如上文公开内容所涵盖的那些)，以活化和/或扩增分离的CAR表达细胞，或基本由其组成。在一些实施方案中，该细胞将用于FLT3 CAR疗法。在进一步的实施方案中，试剂盒包含关于将分离的细胞施用至需要FLT3 CAR疗法的患者的说明。

本公开的试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可包含检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还可以包含对照样品或一系列对照样品，可以对其进行分析并将其与测试样品进行比较。试剂盒的每个组件都可以封装在单独的容器中，所有各种容器都可以放在单个包装中，连同解释使用该试剂盒进行的测定结果的说明。本公开的试剂盒可以在试剂盒容器上或之中包含书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂。

可以适当地，这些建议的试剂盒组分可以以本领域技术人员惯用的方式包装。例如，这些建议的试剂盒组分可以以溶液或液体分散体等形式提供。

以下实施例说明了可在各种实例中用于使本发明生效的过程。

实施例1：FLT3 CAR和分泌的PD-1/PD-L1

FLT3 CAR T细胞不仅诱导针对FLT3(+)AML细胞系的时间依赖性和剂量依赖性细胞毒性，而且在短短4小时内杀死多达40％的FLT3(+)原代AML患者胚细胞。更重要的是，申请人发现长时间培养的CAR NK细胞或NK细胞表达大量的检查点蛋白PD-1，这对癌症患者NK细胞具有抑制信号，而AML胚细胞在细胞表面上表达PD-L1。从该先前的双特异性平台和其他群组来看，双特异性抗体(“biAb”)的主要问题是半衰期短，从而限制了生物利用度和功效。因此，申请人寻求克服该技术限制，并通过增加参与、增加激活和拮抗检查点抑制来提供针对AML的协同溶细胞活性。

CAR NK细胞的功效

可以在体外评估组成型分泌抗PD-1-PD-L1 biAb的CAR NK细胞的功效。已经产生了具有PD-1-PD-L1双特异性抗体的连续且高度分泌的FLT3 CAR-NK克隆，并且可以在体外测试针对AML细胞系和患者胚细胞的细胞毒性增加。

为此，产生了抗PD-1-PD-L1 biAb，并将其结合入FLT3 CAR慢病毒载体中。biAb包含带有HMA接头的来自抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体的scFv。抗PD-1scFv-HMA-抗PD-L1 scFv片段的表达受从人免疫球蛋白分子分离的CMV启动子和分泌信号肽的驱动。

为了在体外测试组成型分泌抗PD-1-PD-L1 biAb的CAR NK细胞的功效，将携带新型抗PD-1-PD-L1双特异性抗体的FLT3 CAR转导到细胞中。由于就功效和安全性而言，通过慢病毒系统进行的单一基因转移优于两轮转导，因此，同时表达FLT3和biAb的临床级双顺反子表达载体是优选的。用这种双顺反子FLT3载体转导的CAR T细胞诱导出针对FLT3(+)AML细胞的强力和特异性溶细胞活性。不受理论的束缚，相信FLT3 CAR可以使NK细胞针对FLT3(+)靶标重定向，而抗PD-1-PD-L1 biAb既可以与效应子又可以与靶标结合并充当检查点抑制剂。

还可以评估双顺反子表达载体和FLT3 CAR的细胞表面表达的诱导以及抗PD-1-PD-L1双特异性抗体的连续分泌。由于biAb的体积小，因此评估了其半衰期和生物利用度。不受理论的束缚，相信将分泌的biAb基因插入FLT3 CAR载体可改善双特异性抗体的半衰期和生物利用度。

FLT3 CAR表达可以通过用抗Fab抗体染色和流式细胞术来确定。通过用布雷菲德菌素A阻断分泌途径来评估biAb的蛋白表达，并将细胞渗透并用抗6X组氨酸(6XHis)抗体染色。用于6XHis的ELISA筛选可用于筛选抗PD-1-PD-L1 biAb的高表达候选基因。在细胞表面检测到FLT3 CAR。当对转导的细胞进行细胞内抗6XHis抗体染色时，通过流式细胞仪检测biAb并通过ELISA进行定量。优选并选择FLT3CAR和抗PD-1-PD-L1 biAb的至少一种较高表达。申请人指出，在某些情况下，两种蛋白质的人工表达可能会给细胞造成压力并引发蛋白质错误折叠反应，并可能导致大量细胞死亡。这可以通过使用具有不同驱动强度的临床安全启动子来优化表达来克服。

申请人还可以确定在体外FLT3 CAR-PD-1-PD-L1 biAb治疗是否优于单独的FLT3CAR。FLT3 CAR对患者AML胚细胞诱导高达40％的细胞毒性。如果抑制性检查点被biAb阻断，则可进一步提高细胞毒性水平。

还可以评估针对AML细胞系MOLM-13、K562和U937(分别具有高、中和低的PD-L1表达)的细胞毒性的并排比较，以比较在有或没有CAR或抗-PD-1-PD-L1 biAb的情况下的细胞毒性。可以测量和比较在有或没有CAR或双特异性抗体的共培养物中IFN-γ的产生。为了证明这种参与，将过度表达分泌性biAb插入片段(抗PD-1-PD-L1CAR NK细胞)的预先标记的效应细胞与预先标记的AML细胞共培养30分钟。然后收集细胞，并用用鬼笔环肽标记的荧光团染色。用Imagestream X Marker II成像流式细胞仪分析染色的细胞。严格的门控策略后，对免疫突触的频率进行量化并与对照细胞进行比较。为了确定阻断PD-1对NK细胞和CAR信号通路的影响，测量了SHP2(PD-1信号的下游)、AKT(CD28信号的下游)和zap70(TCR信号的下游)的磷酸化。CAR NK细胞上内源性PD-1表达与AML细胞上PD-L1表达的相互作用被拮抗，在联合治疗组的共培养物中观察到特异性裂解的增加。与抗PD-1-PD-L1 CAR NK细胞共培养的免疫突触的频率高于阴性对照(包括空载体对照和无靶标对照)。在用抗PD-1-PD-L1biAb处理后，在带有biAb的CAR NK中检测到SHP2的较低表达，而AKT和zap70将会被磷酸化。虽然NK细胞或T细胞同时表达PD-1和PD-L1，因此抗PD-1-PD-L1 biAb可能会与效应细胞上的PD-1或PD-L1结合，但效应细胞上的CAR仅重靶标到限于恶性AML和骨髓细胞的FLT3(+)细胞。这提供了特异性和安全性。

CAR-NK双特异性细胞延长生存期

测试具有分泌的PD-1-PD-L1的CAR-NK克隆(NK92)(biAb-FLT3 CAR NK)，以确定细胞是否在AML患者衍生的异种移植和白血病干细胞小鼠模型中延长存活时间。申请人发现，用具有分泌的PD-1-PD-L1 biAb的CAR-NK治疗的AML小鼠的存活时间比仅患有白血病或仅使用CAR的小鼠更长。

申请人还评估了FLT3 CAR NK细胞是否在AML细胞系和患者胚细胞之间诱导了显著的溶细胞活性。FLT-3CAR可以在人原代CD3(+)T和NK细胞上构建并表达。CAR NK细胞特异性杀死FLT3(+)AML细胞系MOLM-3和EOL-1，但不杀死阴性对照细胞系U937(图2A)。类似地，CAR T细胞诱导针对来自AML患者的FLT3(+)胚细胞的溶细胞活性，但不诱导针对FLT3(-)AML胚细胞的溶细胞活性(图2B)。尽管包括CD34(+)造血干细胞、树突状细胞、NK和B细胞的人类正常细胞表达了FLT-3，但没有明显的杀伤力(图2C)。这表明FLT3 CAR T细胞或NK细胞可能是安全的。

FLT3 CAR T细胞延长了携带MOLM-13AML细胞和来自患者的原代AML胚细胞的小鼠的存活。将注射了AML细胞系或原代AML胚细胞的NOD-SCID

FLT3 CAR T细胞在扩增阶段表达PD-1，而AML胚细胞表达PD-L1。申请人发现FLT3CAR NK细胞在培养物中表达高水平的PD-1。培养7天后，PD-1(+)CAR NK细胞的百分比超过90％(图4A)。在存在γ链细胞因子的情况下，没有CAR转导的原代NK细胞也表达PD-1(图4B)。此外，AML细胞系以不同的水平表达PD-L1。高效表达包括K562；低表达者包括Molm-13(图4C-D)。这些结果表明PD-1-PD-L1轴在CAR-NK对AML细胞的细胞毒性中起潜在作用。申请人还发现，在转导后3天，在用biAb载体转导的T细胞的培养上清液中可以检测到10ng/mL的biAb(图4E)。

这些结果表明，FLT3 CAR T或NK细胞可以保护大多数AML小鼠免于死亡。不受理论的束缚，相信通过用分泌的biAb拮抗PD-1和PD-L1，CAR NK细胞使小鼠免受AML LSC(AML中的白血病干细胞)的侵害。

申请人还测试了AML小鼠中FLT3 CAR-PD-1-PD-L1 biAb治疗是否比单独使用FLT3CAR更好。数据显示，尽管FLT3 CAR T细胞可以延长AML小鼠模型中的存活时间，但CAR T细胞表达高水平的PD-1。申请人还检测到CAR NK细胞中PD-1表达增加。因此，申请人认为，用biAb拮抗PD-1-PD-L1在使用细胞系或患者来源异种移植物建立的AML小鼠模型中增强了CAR的功能并根除了AML细胞。

用荧光素酶转导的MOLM-13(FLT3(+)AML细胞系)接种Nod scidγ(NSG)小鼠。接种一周后，静脉注射含或不含抗PD-1-PD-L1 biAb的FLT3 CAR-NK。通过IVIS Lumina II每周都会通过测量来自AML细胞的生物发光信号来跟踪注射的AML细胞的动力学。在特定的时间点(从体内成像指导)，申请人收获了血液、骨髓和脾脏，并确定了AML和NK细胞的绝对数量。通过流式细胞术测定每周采样的外周血中CAR NK细胞上PD-1的表达。可以通过注射以FLT3表达百分比分层的原代AML患者原始样本来重复该实验。还可以确定PD-L1在注射的AML细胞上的表达。抗PD-1-PD-L1 biAb的浓度是通过ELISA定期测量的，具有抗PD-1-PD-L1 biAb的CAR NK细胞比不具有的细胞体内持久或增殖得更好。在带有biAb的CAR-NK中未检测到分别在CAR NK细胞和AML细胞上的PD-1或PD-L1表达。此外，biAb-FLT3 CAR NK组的AML细胞生物发光最低。在接受biAb-FLT3 CAR NK治疗的小鼠中显示了更长的无病生存期。定期在血浆样品中测试抗PD-1-PD-L1 biAb。在某些情况下，biAb的作用可能取决于PBMC中其他免疫细胞的作用。在这种情况下，申请人可以将自体PBMC和biAb-FLT3 CAR NK细胞共注射到AML小鼠模型中，并与未注射PBMC的进行比较。

申请人还确定了PD-1-PD-L1 biAb-FLT3 CAR NK细胞是否杀死白血病干细胞(LSC)并保护小鼠免于复发。白血病干细胞最初在AML中被描述为AML胚细胞的一小部分，通常是CD34(+)CD38(-)CD123(+)，可以再生为大量AML胚细胞。这在临床上是相关的，因为标准治疗会在AML中保留该部分，从而导致AML患者复发并产生抗药性。众所周知，富集的白血病干细胞群体带有FLT3基因的内部串联复制。

细胞毒性测定是使用富含LSC的样品在体外进行的。通过分选CD34(+)CD38(+)CD123(+)细胞，可以富集AML患者的样本。通过分选CD34(+)CD38(+)细胞而富集FLT3 CAR-NK或biAb-FLT3 CAR NK细胞。申请人还测量了两组细胞产生的IFN-γ，并与用单独的靶/单独的效应子转导的细胞进行了比较。在体内，在注射白血病细胞的前一天，以100Rad照射NOD-SCIDIL2γc-/-小鼠(雌性和雄性)。一天后，通过流式细胞分选仪(BD Aria III)新鲜分选定义为CD34(+)CD38(-)CD123(+)的LSC和阴性对照CD34(+)CD38(+)，并将会通过尾静脉注射1×10

安全性

使用人源化AML患者来源的小鼠模型在体内测试了biAb-FLT3 CAR NK细胞的安全性。在用FLT3 CAR-NK和抗PD-1-PD-L1 biAb治疗的小鼠中未观察到严重的细胞因子风暴。

申请人观察到FLT3 CAR T细胞不会杀死CD34(+)干细胞。不受理论的束缚，申请人相信biAb-FLT3 CAR NK保存正常的干细胞并提供针对FLT3(+)AML细胞的特异性细胞毒性。但是，由于FLT3在髓样细胞和干细胞上均表达，因此可以测试FLT3 CAR NK细胞以确定正常的造血干细胞是否枯竭并有血细胞减少的危险。

申请人还测试了具有分泌性biAb的FLT3 CAR-NK是否会杀死正常的FLT3(+)细胞。不受理论的束缚，相信拮抗PD-1/PD-L1对CAR活化提供协同作用。这可能会增加针对所有正常FLT3(+)细胞的细胞毒性风险，即使它们可能仅弱表达FLT3。因此，使用biAb-FLT3 CARNK作为效应子和从脐带血分离的正常CD34(+)干细胞作为靶标以不同的效应子与靶标比率进行细胞毒性测定。

为了验证体外数据，使用了表达人IL3、GM-CSF和SCF的NSG-SGM3(NSGS)小鼠。将人CD34(+)干细胞和FLT3 CAR NK细胞或biAb-FLT3 CAR NK静脉注射每只小鼠5×10

统计考量

对于所有功效计算，测试是双向的。申请人对大多数连续测量使用对数转换，对百分比使用反正弦平方根转换，这两种方法都具有出色的方差稳定特性，可汇总方差。即使在功效计算中使用Bonferroni方法来控制I型错误，但在执行成对比较时，Holm或更强大的方法仍将用于数据分析。绘制Kaplan-Meier曲线以显示存活结果。线性混合效应模型用于检测小鼠存活期研究中反复采集的血样中IFN-γ产生的变化趋势。将使用两个样本t检验进行分析。为了研究各组之间CAR NK细胞数量的差异，每组包括八只小鼠，这将获得80％的功效以检测至少2倍的效应(α＝0.05/3以调整两个治疗组和一个单独的AML组，CV＝50％)。将使用两个样本t检验进行分析。

讨论

申请人的结果证实了抗PD-1-PD-L1 biAb如何影响CAR-NK功能，从而导致开发出一种新型的细胞疗法，其通过CAR和抗PD-1-PD-L1 biAb增强了针对AML的作用。不受理论的束缚，相信这种方法是对AML微环境中CAR-NK功能的持久性的补充。CAR和biAb技术的优点相结合，使biAb在体内的功能更加强大。仅针对分泌的抗PD-1和抗PD-L1，即不是双特异性构建体，进行了进一步的研究。

申请人的抗PD-1-PD-L1 biAb结合了CAR和双特异性抗体技术，其中组成性分泌的biAb解决了该领域中的潜在问题，例如半衰期短、蛋白质生产和纯化成本高。抗PD-1-PD-L1biAb对效应细胞和靶细胞均具有对检查点的中和能力。它是独一无二的，并且是该领域的首创。检查点抑制剂具有全身毒性。相反，抗-PD-1-PD-L1 biAb具有低毒性，因为其拮抗作用仅限于效应细胞附近的癌细胞。通过拮抗PD-1/PD-L1进行细胞治疗来增强CAR NK细胞的功能是创新的，尚未见报道。这项研究提高了治疗效果的可持续性。申请人的研究也有益于使用NK细胞的其他细胞疗法。PD-1-PD-L1biAb在CAR-NK上的细胞表达是新颖的。表达载体中PD-1-PD-L1 biAb的分泌型设计使PD-1-PD-L1双特异性抗体的分泌无处不在。这绕开了双特异性抗体的蛋白质生产和给药麻烦。这反过来大大增加了这种小双特异性抗体的生物利用度。

实施例2：PD-1和PD-L1抗体

用PD-1抗体和PD-L1抗体(即非双特异性)证明了类似的成功(图8A-8B和图9)。以上研究对PD-1抗体和PD-L1抗体(即非双特异性)进行了重复。

实施例3：FLT3抑制剂共同施用

进行了进一步的实验以确定施用FLT3抑制剂后FLT3表达是否增加。结果示于图图10和图11。图10显示了用10μM米哚妥林、FF-10101、奎扎替尼(AC220)和多韦替尼(TKI-258)FFLT3抑制剂处理48小时的MOLM-13、U937、THP-1、MV4-11和EOL-1AML细胞系中表面FLT3表达的检测。用FLT3抑制剂处理后，FLT3表面表达上调。图11描绘了通过流式细胞术在用米米哚妥林治疗48小时的患者的外周血样品中对表面FLT3表达的检测。处理后，FLT3表面表达上调。

等效物

除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。

可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。

因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和实施例是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。

本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。

此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。

在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。

在以下权利要求中阐述了其他方面。

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靶向FLT3、PD

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