王伟， 曹霞， 童珊珊， 余江南， 徐希明

(江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013)

葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A, SPA)是一种存在于葡萄球菌细胞壁的表面蛋白[1]，约占整个细胞壁蛋白质成分6.7%，通过羧基端与细胞壁肽聚糖呈共价连接。SPA多肽链由A、B、C、D、E五个同源区组成，每个同源区都能与人及某些哺乳动物血清中IgG的Fc片段结合，同时又不会对抗体分子Fab片段与抗原结合位点的活性产生影响[2]。另外，SPA在与IgG的Fc片段结合的同时还能固定酶、荧光标记物等。

荧光免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性反应的新型膜检测技术[3]。其中，荧光标记物包括荧光素[4]、胶体金[5]、量子点[6]等，其中量子点激发光谱宽、发射光谱窄[7]，荧光发射强度强而稳定，耐光漂白，成为荧光免疫层析检测领域的新热点。在荧光免疫层析技术的应用中，每检测一种抗原或抗体都需要将荧光标记物固定于相应的抗原或抗体上，探索最优结合条件，这为荧光免疫层析技术的广泛应用带来了不便。因此，作者提出一种设想，将荧光标记物与SPA结合而形成结合物，该结合物可以与人血清中的一些抗体结合而不影响该抗体与抗原结合位点的活性。

CdCl2·2.5H2O、硼氢化钠、碲粉、丙酮和甲醇(国药集团化学试剂有限公司)；巯基丙酸和罗丹明B(阿拉丁试剂有限公司)；SPA购自南京福麦斯公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均为美国Sigma公司产品；琼脂糖(德国Biofroxx公司)；超纯水(上海Canrex分析仪器)。

1.2.1 碲化镉量子点的制备

1.2.1.1 碲氢化钠前驱体溶液的制备 碲氢化钠采用硼氢化钠还原法制备，反应方程式如下：4NaBH4+2Te+7H2O=2NaHTe+Na2B4O7+14H2↑。

超纯水通氮气30 min除氧备用；称取0.160 5 g碲粉，0.163 8 g硼氢化钠于100 mL三颈烧瓶中，加入适量除氧后的超纯水，通氮气于40 ℃水浴加热反应1 h，反应液从黑色逐渐变为淡紫色，得到新鲜制备的碲氢化钠溶液。

1.2.1.2 镉溶液的制备 称取CdCl2·2.5H2O 0.228 0 g于250 mL三颈烧瓶中，加入适量除氧后的超纯水溶解，加入260 μL巯基丙酸，混合均匀，逐滴滴加1 mol/L的氢氧化钠溶液，快速调节溶液pH至9，在此过程中，溶液先由无色变为白色混浊液，再变为无色透明溶液，然后通氮气30 min。

1.2.1.3 巯基丙酸包被的碲化镉量子点溶液的制备 按照镉碲比为1 ∶2的比例吸取适量碲氢化钠溶液注入镉溶液中，操作过程全程通氮气，然后，在油浴加热搅拌的情况下回流3 h。

1.2.1.4 量子点溶液的纯化 取适量量子点溶液于10 mL试管中，按照1 ∶2的比例添加丙酮，涡旋振荡混合均匀；3 000 r/min离心30 min，弃上清液；加入适量甲醇混匀，3 000 r/min离心20 min；弃上清液，甲醇洗涤3次；37 ℃烘干，加超纯水溶解，冷冻干燥备用，量子点溶液避光保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 碲化镉量子点的表征

1.2.2.1 荧光量子产率的测定 罗丹明B是一种优良的荧光染料，稳定好，荧光量子产率高，在514 nm激发波长处量子产率是31%。称取适量的罗丹明B粉末，配制成浓度为4 μg/mL的罗丹明B水溶液，避光保存；测定罗丹明B在514 nm处的光密度以及在514 nm激发波长处的荧光光谱，得到荧光峰积分面积。

稀释制备好的量子点溶液，使得碲化镉量子点溶液在514 nm处光密度小于0.1，并测定该浓度下碲化镉量子点在514 nm激发波长处的荧光光谱，得到荧光峰积分面积，根据下列公式(1)计算碲化镉量子点的荧光量子产率[8]：

(1)

式中，Yu和Ys分别表示量子点和罗丹明B的荧光量子产率，Au和As分别表示量子点和罗丹明B在514 nm激发波长处的光密度，η表示溶液的折射率，Fu和Fs分别表示量子点和罗丹明B荧光峰的积分面积。

1.2.2.2 粒径和电位 取适量碲化镉量子点溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，使用布鲁克海文Zeta电位及激光粒度分析仪测定其粒径和电位。

1.2.2.3 量子点溶液的紫外光谱和摩尔浓度 取适量碲化镉量子点溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，使用紫外分光光度计扫描得到全波长图，根据公式(2)、(3)计算量子点溶液的摩尔浓度[9-10]。

ε=10 043·(D)2.12

(2)

Am=εCL

(3)

式中，D为量子点粒径，ε为量子点摩尔系数，C为摩尔浓度，L为1，Am是量子点长波长侧的第一个吸收峰峰值处的光密度。

1.2.3 量子点-SPA偶联物的制备 吸取适量量子点溶液，10 000 r/min离心5 min，去除量子点团聚物。新鲜配制10 mg/mL 的 EDC溶液和NHS溶液；取适量EDC溶液加入碲化镉量子点溶液中，振荡混合15 min；再取适量NHS溶液加入碲化镉量子点溶液中，振荡混合15 min；立即加入适量SPA溶液，于涡旋混合振荡器上混合均匀；放于37 ℃恒温振荡水浴箱中反应2 h；冷却至室温，10 000 r/min，离心2 min；去除量子点团聚物，4 ℃保存。吸取适量量子点溶液，10 000 r/min，离心5 min，去除量子点团聚物。新鲜配制10 mg/mL EDC溶液和NHS溶液；取适量EDC溶液加入碲化镉量子点溶液中，振荡混合15 min；再取适量NHS溶液加入碲化镉量子点溶液中，振荡混合15 min；立即加入适量SPA溶液，混合均匀，放入37 ℃恒温振荡水浴箱中反应；冷却至室温，10 000 r/min离心2 min；去除量子点团聚物，4 ℃保存。制备1%琼脂糖凝胶，以游离量子点做对照，将样品依次点样于凝胶样品孔中，80 V电泳30 min；分别使用手提式紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)和AI680超灵敏多功能成像仪(美国通用电气公司)拍摄凝胶成像图。

1.2.4 量子点-SPA偶联物制备条件的优化

1.2.4.1 碲化镉量子点和EDC的摩尔比 本部分在预实验的基础上探究量子点和EDC的摩尔比在1 ∶500，1 ∶1 000，1 ∶1 500，1 ∶2 000时的偶联效率，以偶联物的荧光强度为指标确定合适的量子点和EDC的比例。

1.2.4.2 碲化镉量子点和NHS的摩尔比 本部分在确定合适的EDC用量的基础上，探究EDC和NHS的摩尔比在1 ∶0.5，1 ∶1.0，1 ∶2.0，1 ∶2.5，1 ∶3.0，1 ∶4.0时的偶联物制备效率，以偶联物的荧光强度为指标确定合适的EDC和NHS比例。

1.2.4.3 反应时间 本部分在已确定EDC、NHS基础上选择1，2，3，4 h反应时间探究其对偶联物制备效率的影响。

1.2.4.4 SPA的用量 为保证偶联过程中蛋白完全反应，量子点的用量是过量的。本部分在上述筛选出的适宜的EDC、NHS用量和反应时间的基础上探究不同蛋白用量的偶联效率。配制10 mg/mL的SPA溶液，分别吸取1.5、2.5、4.0、5.5、7.0 μL蛋白溶液用于偶联反应，以偶联物荧光强度为指标确定合适的SPA用量。

1.2.5 量子点-SPA偶联物的表征 在最优偶联条件下制备量子点-SPA偶联物，测定其紫外吸收光谱和荧光发射光谱。

2.1.1 荧光量子产率 碲化镉量子点和罗丹明B在514 nm处光密度和荧光峰面积如表1所示，按照公式(1)计算可得碲化镉量子点荧光量子产率为24%。

表1 碲化镉量子点和罗丹明B在514 nm处光密度和荧光峰面积

2.1.2 粒径和电位 碲化镉量子点粒径分布图如图1所示，碲化镉量子点粒径主要分布在5～15 nm之间，其有效粒径为9 nm，电位为-20 mV，量子点绝对电位值相对较小，这可能与量子点表面配体键合数量有关。

图1 碲化镉量子点粒径图

2.1.3 紫外光谱和摩尔浓度 碲化镉量子点紫外全波长扫描图如图2所示，其长波长侧最大吸收峰位于480 nm处，光密度为4.032，按照公式(2)和(3)计算可得碲化镉量子点摩尔浓度为3.8×10-6mol/L。

图2 碲化镉量子点紫外全波长扫描图

2.2.1 碲化镉量子点和EDC的摩尔比对量子点-SPA偶联物制备的影响 由图3观察可知，量子点和EDC比例为1 ∶500，1 ∶1 000，1 ∶1 500的三个孔道中存在与游离量子点同一高度的荧光点，这说明偶联反应中量子点的量是过量的；另外，偶联物的荧光强度随着EDC用量增加呈先增强后降低的趋势。由灰度值柱状图可确定最合适的量子点和EDC用量比例是1 ∶1 500。

左上图为紫外灯下拍摄；①: 游离量子点；②～⑤: 量子点 ∶EDC分别为1 ∶500，1 ∶1 000，1 ∶1 500，1 ∶2 000图3 不同量子点和EDC比例偶联物电泳凝胶成像图及其灰度值

2.2.2 碲化镉量子点和NHS的摩尔比对量子点-SPA偶联物制备的影响 从图4观察可知，6个样品孔中都有与游离量子点同一高度的荧光点，这同样说明量子点的用量是过量的；另外，EDC ∶NHS为1 ∶0.5，1 ∶1.0，1 ∶2.0，1 ∶2.5，1 ∶3.0时，偶联物荧光强度相近，肉眼无法分辨强弱；而EDC和NHS比例为1 ∶4.0时，偶联物荧光强度明显较弱。由图可知，EDC ∶NHS为1 ∶2.0时，偶联物灰度值最高，这说明该比例下偶联物荧光强度最高。

左上图为紫外灯下拍摄；①: 游离量子点；②～⑦: EDC ∶NHS分别为1 ∶0.5，1 ∶1.0，1 ∶2.0，1 ∶2.5，1 ∶3.0，1 ∶4.0图4 不同EDC和NHS比例偶联物电泳凝胶成像图及其灰度值

2.2.3 反应时间对量子点-SPA偶联物制备的影响 由图5观察可知，反应时间为2 h时，偶联物荧光强度最强，这与已有文献报道一致[11]，3 h和4 h偶联物荧光强度降低。

左上图为紫外灯下拍摄；①: 游离量子点；②～⑤分别为反应时间1，2，3，4 h图5 不同反应时间偶联物电泳凝胶成像图及其灰度值

2.2.4 SPA的用量对量子点-SPA偶联物制备的影响 由图6观察可知，随着SPA用量增加，偶联物荧光强度逐渐增强，当SPA用量超过4.0 μL时，偶联物荧光强度不再随着SPA用量增加而增强。由图可知，SPA用量为5.5 μL和7.0 μL时，偶联物灰度值稍弱于4.0 μL。

左上图为紫外灯下拍摄；①: 游离量子点；②～⑥分别为SPA用量1.5，2.5，4.0，5.5，7.0 μL图6 不同SPA用量偶联物电泳凝胶成像图及其灰度值

碲化镉量子点-SPA偶联物紫外吸收图和荧光光谱如图7所示。由紫外吸收图可知，碲化镉量子点-SPA偶联物紫外吸收峰发生红移；由荧光光谱图可知，碲化镉量子点-SPA偶联物与单纯量子点相比，其最大发射波长发生红移。另外，偶联物荧光强度相比单纯量子点，其荧光强度略有降低，说明偶联过程对量子点的荧光产生了一定影响。

图7 量子点-SPA偶联物紫外吸收光谱和荧光光谱

量子点的制备方法有多种，本文采用的是“经典注入法”，该方法技术成熟，安全可靠[12]。碲化镉量子点是众多量子点中应用较为广泛的一种，巯基丙酸是其常用的羧基修饰物，除此之外，巯基乙酸、谷胱甘肽等也可以用于修饰碲化镉量子点。碲化镉量子点制备过程中，回流时间延长，量子点粒径及荧光颜色都会随之改变，其粒径一般在10 nm以内，本研究所制备的量子点与其相符合[13]。本研究所制备的量子点电位为-20 mV，其原因可能是量子点颗粒表面键合的巯基丙酸相对较少。此外，本研究量子点制备过程中回流时间为3 h，该反应时间下量子点荧光强度和稳定性较好。

研究发现，偶联反应在EDC最适pH 4～6时[14]，量子点溶液稳定性较低，易发生团聚及荧光猝灭，实际使用中pH 7～9都可用于偶联反应。在偶联反应中，EDC首先将量子点表面的羧基活化，形成中间产物，该中间产物稳定性不高，此时，NHS可与活化中间产物结合，提高活化中间产物的稳定性，进而提高偶联效率。本研究中，最适量子点 ∶EDC ∶NHS为1 ∶1 500 ∶3 000，此时偶联物荧光强度较好；而EDC和NHS过量时，会改变量子点纳米颗粒的表面电位，导致量子点发生团聚，荧光猝灭。另外，长时间的偶联反应会导致量子点稳定性减小，发生团聚，致使偶联物荧光强度降低；过量SPA会包裹量子点使其荧光无法被激发，致使荧光强度相对减小。

本研究制备的偶联物紫外吸收峰和荧光最大发射峰均发生红移，该情况与已有文献报道[11]相符。这是因为SPA分子具有多个氨基可与多个量子点发生偶联，偶联后偶联物粒径增大，发生量子尺寸效应。

在量子点荧光免疫层析技术的应用过程中，最重要的问题是量子点和抗原或抗体偶联物的制备。不同的抗体或抗原与量子点偶联时，其反应条件不同，EDC、NHS、抗原或抗体的用量都会影响偶联效果，这也导致使用量子点荧光免疫层析技术每检测一种蛋白时，都需要重新探究最佳偶联反应条件。

由于SPA本身特有的生物活性，量子点-SPA偶联物可以代替量子点和待测物相应抗体或抗原的偶合物。因而，在使用量子点荧光免疫层析技术时，只有固定相需要重新制备。

综上所述，“经典注入法”可以制备得到荧光强度较好的羧基化的碲化镉量子点，其可以与SPA偶联，得到荧光强度优良的偶合物。

江苏大学学报（医学版）2021年3期