一、Primer-BLAST 介绍

Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-Blast 可以直接从 Blast 主页（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ）找到， 或是直接用下面的链接进入：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的 Primer3 软件，再加上NCBI 的Blast 进行引物特异性的验证。

Primer-BLAST 免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤， 设计好的引物程序直接用 Blast 进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST 能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3 和 NCBI BLAST 更加准确。

二、Primer-BLAST 的输入

Primer-BLAST 界面包括了 Primer3 和 BLAST 的功能。提交的界面主要包括三个部分：targettemplate（模板区）, the primers（引物区）, 和 specificity check（特异性验证区）。跟其它的 BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。

（1） 模板（Template）

在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA 格式或直接用 Acession Number，如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在 specificity check 区选择）是唯一的。

（2） 引物（Primers）

如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在 Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在 specificity check 区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。

（3） 特异性（Specificity）

在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了 4 种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据， 这样可以给出更准确的结果。

特别是，当你用 NCBI 的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种：human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee,Arabidopsis, 和 rice。Nr 数据库覆盖 NCBI 所有的物种。

三、实例分析

用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1 的序列长一点（NM_003362），UNG2 的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列 ClustalW 一下就可以了）。

这里用 UNG2 的序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database，物种是 Human，其它默认。结果如下图 A-B所示，设计的引物只能扩增出 UNG2。

看上面的图，把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C 所示，新的引物也可以扩增出 UNG1（注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）。

Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences. Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to allow splice variants.

四、一些 Tips‍‍‍

1，在任何时候都要优先使用参考序列的 Gi 号或Accession 号（尽量不要 Fasta 格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填 Accession Number 时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）

2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用 Gi号或Accession 号（Primer-BLAST 有参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”，如上面的第一幅图所示）。因为用 Gi 号或Accession 号，NCBI 会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。

3，尽量使用没有冗除的数据库（如 refseq_rna 或 genome database），nr 数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。

4，请指定一个或几个 PCR 扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。

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